Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Summary

Chirp ist eine neuartige und schnelle Technik, um genomische Bindungsstellen der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) abzubilden. Die Methode nutzt die Spezifität der anti-sense-Oligonukleotide Fliesen um die Auszählung von lncRNA-gebundene genomische Stellen zu ermöglichen.

Abstract

Lange-kodierende RNAs sind wichtige Regulatoren der Chromatin Staaten für wichtige biologische Prozesse wie Dosiskompensation, Imprinting und Entwicklungsstörungen Genexpression ^{1,2,3,4,5,6,7.} Die jüngste Entdeckung von Tausenden von lncRNAs in Verbindung mit spezifischen Modifikation Chromatin-Komplexe wie Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) vermittelt, dass Histon H3 Lysin 27 Trimethylierung (H3K27me3), breite Rollen für zahlreiche lncRNAs bei der Verwaltung von Chromatin-Staaten in einer Gen-spezifischen schlägt Mode ^8,9. Während einige lncRNAs gedacht werden, um in cis auf benachbarte Gene arbeiten, arbeiten andere lncRNAs in trans zu weit entfernten Gene regulieren. Zum Beispiel sind Drosophila lncRNAs roX1 und roX2 bind zahlreichen Regionen auf dem X-Chromosom der männlichen Zellen, und entscheidend für Dosiskompensation ^10,11. Allerdings sind die genauen Standorte von ihren Bindungsstellen nicht mit hoher Auflösung bekannt. In ähnlicher Weise können menschliche lncRNA HOTAIR PRC2 Belegung auf h beeinflussenundreds von Genen genomweiten ^3,12,13, aber wie Spezifität erreicht wird, ist unklar. LncRNAs kann auch als Modulgerüsten dienen dazu, die Montage von mehreren Protein-Komplexe zu rekrutieren. Die klassische trans-agierende RNA-Gerüst ist die TERC RNA, die als Vorlage und Gerüst für die Telomerase-Komplex ¹⁴ dient; HOTAIR kann auch als Gerüst für PRC2 und einem H3K4 Demethylase Komplex ¹³ zu dienen.

Frühere Studien Mapping RNA-Belegung am Chromatin haben gezeigt, wesentliche Einblicke ^15,16, aber nur an einem einzigen Gen-Locus zu einer Zeit. Die Belegung der meisten Websites lncRNAs sind nicht bekannt, und die Rollen von lncRNAs in Chromatin Regulation wurden zumeist aus den indirekten Auswirkungen der lncRNA Störung abgeleitet. So wie Chromatin-Immunopräzipitation von Microarray-oder tief-Sequenzierung (ChIP-Chip oder Chip-seq bezeichnet) verfolgt hat, unser Verständnis von Protein-DNA-Wechselwirkungen im genomischen Maßstab verbessert, hier haben wir veranschaulichen eine recenTLY veröffentlichten Strategie zu lange RNA-Belegung genomweiten bei hoher Auflösung ¹⁷ Karte. Chromatin-Komplex, der durch Antisense-Oligonukleotide Tiling, der dann eine Karte der genomischen Bindestellen bei einer Auflösung von mehreren hundert Basen mit: Diese Methode, Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp) (Abbildung 1), basiert auf Affinität Erfassung von Soll-lncRNA Basis hoher Empfindlichkeit und geringem Hintergrund. Chirp ist auf viele lncRNAs, weil das Design der Affinitäts-Sonden ist einfach aufgrund der RNA-Sequenz und erfordert keine Kenntnis der RNA-Struktur oder funktionelle Domänen.

Protocol

1. OEM Anwendungen Design Anti-sense DNA Fliesen Sonden für die selektive Abrufen von Ziel-RNA von Chirp. Design-Antisense-Oligo Probes mit dem Online-Sonde Designer bei singlemoleculefish.com 18. Verwenden Sie diese Parameter: Anzahl der Sonden = 1 Sonde / 100 bp Länge von RNA; 2) Ziel GC% = 45, 3) Oligonukleotid-Länge = 20; 4) Abstand Länge = 60-80. Brechen RNA in Segmente, wenn zu lange für den Konstrukteur. Lassen Sie Regionen von Wiederholungen oder weitgehende Homologie. Auftrag Antisense-DNA-Sonden mit BiotinTEG am 3'-Ende Ende. Markierungs-Sonden entsprechend ihrer Position entlang der RNA. Trennen Sie sie in zwei Pools, so dass die "geraden" Pool enthält alle Sonden Nummerierung 2, 4, 6, usw. und die "ungeraden" Pool enthält Sonden Nummerierung 1, 3, 5, usw. verdünnen Pool von Sonden bis 100 uM Konzentration und Lagerung bei -20 ° C. Alle Experimente sind mit handelsüblicherBeide Pools, die als interne Kontrollen für einander zu dienen. Echte RNA-abhängige Signal vorhanden wäre von beiden Pools, während Sonden-spezifischen Geräusche wäre einzigartig für jeden Pool. Dies gilt sowohl für CHIRP qPCR-und Chirp-seq. 2. Ernten Sie die Zellen Sammeln Zellen, die für die Chirp-Experiment verwendet werden. Kultivieren von Zellen in Gewebekulturplatten oder Kolben bis zur Konfluenz. Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) einmal und trypsinieren. Quench mit Trypsin> 2x Volumen von Medien, Pipette auf und ab, um Zellen zu verdrängen und resuspendieren in einzelne Zell-Suspension. Übertragen Sie alle Medien und resuspendierten Zellen in 50 ml Falcon-Röhrchen. 20 Millionen Zellen sind in der Regel ausreichend für ein CHIRP Probe. Spin-Zellen bei 800RCF für 4 min. Aspirieren Medien und resuspendieren 40 Millionen Zellen in 40 ml PBS, Rohre verbinden, wenn nötig. Spin-Zellen bei 800RCF für 4 min. Dekantieren PBS, sorgfältig auf einem Winkel die verbleibende Flüssigkeit abzusaugen. </ol> 3. Cross-Link-Cells und Sammeln Zellpellet Crosslink gesammelten Zellen mit Glutaraldehyd zu RNA-Chromatin-Wechselwirkungen zu erhalten und bereiten Zellpellet. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. Bereiten Sie 1% Glutaraldehyd in PBS Raumtemperatur. Bereiten Sie 10 ml pro 10 Millionen Zellen (0,4 ml 25% Glutaraldehyd Lager + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyd muss frisch verwendet werden. Tippen Sie unten auf Falcon-Röhrchen, um Pellets zu entfernen. Resuspendieren Zellpellet in 1% Glutaraldehyd, beginnend mit einem kleinen Volumen zu Klumpen zu vermeiden, dann von oben bis zur vollen Lautstärke. Umkehren, um zu mischen. Crosslink für 10min bei Raumtemperatur auf einer End-to-End-Schüttler oder Rotator. Quench die Vernetzungsreaktion mit 1:10 Volumen von 1,25 M Glycin bei Raumtemperatur für 5 min. Drehen am 2000RCF für 5 min. Absaugen des Überstandes und Waschen Pellet mit 20 ml PBS gekühlt einmal drehende 2000RCF für 5 min. Aspirieren und resuspendieren Sie das wveraschten, vernetzten Pellet mit 1 ml gekühltem PBS pro 20 Millionen Zellen. Übertragen Sie jede ml in ein Eppendorf-Röhrchen und drehen sich mit 2000RCF für 3 min bei 4 C. Entfernen Sie so viel wie möglich mit PBS Pipettenspitze vorsichtig. Flash-frieren der Zellpellets in flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 ° C auf unbestimmte Zeit. 4. Cell Lysis Lyse vernetzten Zellen zu Zelllysat vorzubereiten. Eingefrorene Zellpellets bei Raumtemperatur. Tippen schwer zu lösen und das Zellpellet zu mischen. Drehen Sie das Pellet bei 2000RCF für 3 min bei 4 ° C Mit einem scharfen 10 pl Pipettenspitze, um alle verbleibenden PBS zu entfernen. Auf einer elektronischen Waage (Genauigkeit 1 mg) Tara die Masse eines leeren Eppendorf-Röhrchen (unsere Rohre wiegen 1,060 Gramm sehr konsequent). Wiegen Sie jedes Pellet und notieren ihr Gewicht. Eine volle 15 cm Schale aus vernetztem HeLa-Zellen in der Regel wiegt 100 mg. Supplement Lysis Buffer (10x die Masse der Pellets, z. B. 1 ml für 100 mg) mit fresh Protease-Inhibitor, PMSF und Superase-in (siehe beigefügte Liste Puffer). Gut mischen. Fügen 10X Volumen ergänzt Lysispuffer in jedes Röhrchen und das Pellet. Für kleine Pellets <25 mg, in 250 ul ergänzt lysepuffer resuspendieren. die aussetzung sollte glatt sein. falls nicht, teilen suspension 500 aliquots und verwenden sie einen motorisierten pellet-mixer zu brechen klumpen. fahren direkt mit beschallung. 5. ultraschallbehandlung shear dna durch beschallung vernetzten zelllysaten. beschallen zelllysat bioruptor 15 ml falcon-röhrchen. <1,5 lysat jedem röhrchen für eine schnellere beschallung, nicht mehr als zwei rohre einer zeit. ultraschall einem 4 ° c wasserbad bei höchster stufe 30 sekunden ein, 45 aus pulspausen. Überprüfen alle min. weiter ultraschallbehandlung, bis das zell-lysat trübe ist. dies kann so wenig wie minuten weniger stunden. anzahlvon rohren, wird probenvolumen, badtemperatur dauer der zeit beeinflussen, lange prozess dauert. tubes wahrscheinlich unterschiedlichen geschwindigkeiten beschallen, bündeln zusammen weiterzuverbreiten original-röhren, um homogenität gewährleisten. hinweis: glutaraldehyd-vernetzten zellen nehmen deutlich länger formaldehyd-Äquivalente beschallen. wenn klar macht, übertragen 5 ein frisches eppendorf-röhrchen. 90 dna-protease k (pk) buffer (siehe liste puffer) pk. vortex mischen kurz abzentrifugieren. inkubieren min 50 extraktion von qiagen pcr purification kit. eluieren elutionspuffer (eb) überprüfen dna-größe auf 1% agarosegel. großteil dna-abstrich ist 100-500 bp, abgeschlossen. zentrifuge beschallten proben 16100rcf 10 kombinieren Überstände, aliquot 1 proben-und flash-freeze flüssiger gasdrucn. lagerung -80 c. 6. chirp hybridisieren biotinylierten dna-sonden an rna isolieren gebundenen chromatin. auftauen chromatin raumtemperatur. bereiten hybridisierungspuffer puffer, 2 pro chromatin). mischen. typische probe lysat, entfernen rna-input dna-input und-ort halten eis zur weiteren verwendung. falcon röhrchen. jedes gesamtvolumen ml, eppendorf-röhrchen verwenden. sonden nanodrop menge nach, es verwendet haben (100 sollten spec ~ 500-600 ng > zeigt die CHIRP Workflow. Eine erfolgreiche CHIRP Experiment typischerweise bereichert Ziel-RNA signifikant gegenüber nicht-spezifische RNAs. 2 zeigt Anreicherung von humanen Telomerase-RNA (TERC) aus HeLa-Zellen über GAPDH, ein reichlich zelluläre RNA, die als negative Kontrolle dient. Mehrheit der TERC RNAs (~ 88%) in der Zelle vorhanden, wurden von der Durchführung CHIRP gezogen, während nur 0,46% der GAPDH-RNA wurde abgerufen, was zeigt, einem Anreicherungsfaktor von ~ 200 fache. Unspezifische Sonden wie Sonden Targeting LacZ-RNA, die nicht in Säugetierzellen (2) ausgedrückt wird, können als zusätzliche negative Kontrollen verwendet werden. DNA-Regionen zu erwarten, um das Ziel zu binden lncRNA werden typischerweise über negativen Bereichen, wenn sie durch qPCR gemessen angereichert. 3 zeigt qPCR Validierung von vier HOTAIR-gebundenen Plattformen primäre humane Vorhautfibroblasten, dass wir durch Ausführen CHIRP-seq in der gleichen Zelllinie bestimmt, während TERC und GAPDH DNA Seiten an sichrve als negative Kontrolle Regionen. Sowohl "gerade" und "ungerade"-Sonde setzt erbrachten vergleichbare Anreicherung erwartet HOTAIR-gebundenen Seiten über Regionen negativ, ein Kennzeichen der wahren lncRNA-Bindungsstellen. Hochdurchsatz-Sequenzierung von Chirp angereicherte DNA ergibt sich eine globale Karte der lncRNA-Bindungsstellen. Die Drosophila lncRNA roX2 ist bekannt, mit dem X-Chromosom in einer Weise, die für die Dosierung Kompensation erforderlich ist interagieren. 4 zeigt roX2 Bindungsprofil über einen Abschnitt des X-Chromosoms. Sowohl "gerade" und "ungerade" Proben wurden sequenziert und ihre einzigartige Geräusche wurden eliminiert, um eine Spur von sich überlappenden Signale zu erzeugen. Jede "Spitze" hier zeigt eine starke Seite von roX2 bindend. Die komplette Liste der Spur und roX2 Zielgene in Chu et al. 2011 17. Abbildung 1. Ablaufschema des Chirp-VerfahDure. Chromatin ist lncRNA vernetzt: Proteinaddukte in vivo biotinylierten Sonden hybridisiert Fliesen zu lncRNA zielen, und Chromatin-Komplexe werden unter Verwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen, gefolgt von strengen Wäschen.. Wir eluieren lncRNA gebundene DNA oder Proteinen mit einem Cocktail von RNase A und H. Eine mutmaßliche lncRNA Bindungssequenz orange schematisiert wird. Zuvor in Chu et al. 2011. 17 Abbildung 2. CHIRP bereichert für den menschlichen TERC RNA. TERC-asDNA Sonden abrufen ~ 88% der zellulären RNA TERC und GAPDH nicht nachweisbar. LacZ-asDNA Sonden werden als negative Kontrollen verwendet und Abrufen weder RNAs. Mittel + SD dargestellt. Zuvor in Chu et al. 2011. 17 Abbildung 3. HOTAIR CHIRP-qPCR in primären humanen fürEskin Fibroblasten. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 und ABCA2 sind Bereiche, die mit HOTAIR interagieren. TERC und GAPDH diente als negative Kontrollen. Mittel + SD dargestellt. Zuvor in Chu et al. 2011. 17 Abbildung 4. CHIRP-seq Daten von roX2 RNA in Sl2 Drosophila-Zellen. "Selbst" und "ungerade" wurden getrennt sequenziert; ihre Daten zusammenführen, um gemeinsam nur Spitzen in beide reflektieren. Das fusionierte Bahn dargestellt. Zuvor in Chu et al. 2011. 17

Discussion

Hier beschrieben CHIRP-seq, ein Verfahren zur Zuordnung in vivo lncRNA Bindungsstellen genomweiten. Die wesentlichen Parameter für Erfolg sind die Split-Pools von Fliesen Oligonukleotid-Sonden und Glutaraldehyd-Vernetzung. Das Design der Sonden-Affinität ist einfach angesichts der RNA-Sequenz und erfordert keine Vorkenntnisse in der RNA-Struktur oder funktionellen Domänen. Unser Erfolg mit roX2, TERC und HOTAIR – drei ziemlich unterschiedlichen RNAs in zwei Arten – legt nahe, dass CHIRP-seq wahrscheinlich verallgemeinerbar zu viele lncRNAs ist. Wie bei allen Experimenten werden Pflege und angemessene Kontrollen erforderlich, um die Ergebnisse zu interpretieren. Verschiedene lncRNA kann Titration von Bedingungen, und vernünftige Änderung der Bedingungen, wie zB Auswahl von verschiedenen Affinitätssonden oder Vernetzer erfordern, kann auf unterschiedliche Aspekte der RNA-Chromatin-Wechselwirkungen. Wie Chip-seq sind nicht alle Bindungsereignisse unbedingt funktional, und weitere Studien sind erforderlich, um die biologischen Folgen der RNA-o ermittelnccupancy auf Chromatin. Dennoch sehen wir viele interessante Anwendungen dieser Technologie für Forscher anderer Chromatin-assoziierten lncRNAs, die jetzt in die Tausende ^8,9. So wie ChIP-seq hat die Tür für genomweite Untersuchungen der DNA-Protein-Interaktionen eröffnet, kann CHIRP-seq Studien des "RNA Interaktom" enthüllen viele neue Wege der Biologie.

Materials

Buffer List:

Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.

Lysis Buffer:

50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer (for DNA)

100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use

Hybridization Buffer

750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use

Wash Buffer

2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use

DNA elution Buffer

50 mM NaHCO3
1% SDS

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma Aldrich	G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer	VWR	V8185-904
Protease inhibitor	Roche	11873580001
PMSF	Sigma Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Falcon tubes (for sonication)	Corning	430790
Proteinase K	Ambion	AM2546
PCR purification kit	Qiagen	28106
C-1 magnetic beads	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma Aldrich	P7626-25G
DynaMag-15 magnet	Invitrogen	123-01D
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	123-21D
MIRNeasy mini kit	Qiagen	217004
Rnase H	Epicentre	R0601K
Rnase A	Sigma Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glycine	J.T. Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Elution Buffer (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
DNA-free	Ambion	AM1906
Buffer kit	Ambion	AM9010
Formamide	Invitrogen	15515-026