Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Summary

Chirp er en roman og rask teknikk for å kartlegge genomisk bindingssteder lange noncoding RNA (lncRNAs). Metoden utnytter den spesifisitet av anti-sense fliser oligonukleotider for å tillate opptellingen av lncRNA-bundet genomisk nettsteder.

Abstract

Lange noncoding RNAS er sentrale regulatorer av kromatin stater for viktige biologiske prosesser som dosering kompensasjon, imprinting, og utviklingsmessige genuttrykk ^{1,2,3,4,5,6,7.} Den nylige oppdagelsen av tusenvis av lncRNAs i forbindelse med konkrete kromatin modifisering komplekser, som Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2) som medierer histone H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3), foreslår brede roller for mange lncRNAs i å håndtere kromatin stater i et gen-spesifikk mote ^8,9. Mens noen lncRNAs er tenkt å fungere i CIS på nærliggende gener, andre lncRNAs jobbe i trans å regulere fjernt beliggende gener. For eksempel Drosophila lncRNAs roX1 og roX2 binder mange regioner på X-kromosomet av mannlige celler, og er kritisk for dosering kompensasjon ^10,11. Imidlertid er de eksakte plasseringen av deres bindingssteder ikke kjent på høy oppløsning. Tilsvarende kan mennesker lncRNA HOTAIR påvirke PRC2 belegg på hundreds av gener genom-wide ^3,12,13, men hvor spesifisitet oppnås er uklart. LncRNAs kan også tjene som modulære stillasene å rekruttere montering av flere protein komplekser. Den klassiske trans-acting RNA stillaset er TERC RNA som fungerer som mal og stillaset for telomerase komplekse ^14; HOTAIR kan også tjene som et stillas for PRC2 og en H3K4 demethylase kompleks ^13.

Tidligere studier kartlegging RNA utleiegrad på kromatin har avdekket betydelige innsikt ^15,16, men bare på ett enkelt gen locus av gangen. Utleiegraden stedene i de fleste lncRNAs er ikke kjent, og rollene til lncRNAs i kromatin regulering har vært mest utledes fra de indirekte virkningene av lncRNA forstyrrelse. Akkurat som kromatin immunoprecipitation etterfulgt av microarray eller dyp-sekvensering (Chip-chip eller chip-seq, henholdsvis) har kraftig forbedret vår forståelse av protein-DNA vekselvirkninger på en genomisk skala, her vi illustrere en recently publisert strategi for å kartlegge lang RNA utleiegrad genom-wide med høy oppløsning ^17. Denne metoden, Chromatin Isolering av RNA Purification (kvitring) (figur 1), er basert på slektskap fangst av målet lncRNA: kromatin kompleks av flislegging antisens-oligos, som deretter genererer et kart over genomisk bindingssteder i en oppløsning på flere hundre baser med høy følsomhet og lavt bakgrunn. Chirp er aktuelt for mange lncRNAs fordi utformingen av affinity-prober er grei gitt RNA sekvensen og krever ingen kunnskap om RNA struktur eller funksjonelle domener.

Protocol

1. Probe Design Design anti-følelse DNA flislegging prober for selektiv uthenting av RNA mål av Chirp. Design anti-sense oligo probes i bruk den elektroniske sonden designer hos singlemoleculefish.com 18. Bruk disse parametrene: antall prober = 1 probe / 100 bp av RNA lengde, 2) Target GC% = 45, 3) Oligonucleotide lengde = 20, 4) Mellomrom lengde = 60-80. Bryt RNA inn i segmenter hvis for lang for designeren. Utelat områder av gjentakelser eller omfattende homologi. Bestill anti-sense DNA prober med BiotinTEG ved 3-prime end. Etiketten sonder etter sine posisjoner langs RNA. Skille dem i to bassenger, slik at "selv" pool inneholder alle sonder 2 nummerering, 4, 6 osv. og "odd" pool inneholder prober nummerering 1, 3, 5 osv. Fortynn pool av sonder til 100 mikrometer konsentrasjon og Oppbevar ved -20 ° C. Alle eksperimenter skal utføres ved hjelpbegge bassengene, som fungerer som interne kontroller for hverandre. Ekte RNA-avhengige signal ville være til stede fra begge bassengene, mens probe-spesifikke lyder ville være unik for hver pool. Dette gjelder for både kvitre-qPCR og chirp-seq. 2. Harvests Celler Samle celler som skal brukes til chirp eksperiment. Grow celler i vev kultur plater eller kolber til confluency. Skyll med fosfat saltløsning (PBS) én gang og trypsinize. Slukk trypsin med> 2x volum av media, pipette opp og ned for å løsne cellene og resuspender i single cellesuspensjon. Overfør alle medier og resuspendert celler inn i 50 ml Falcon rør. 20 millioner celler er vanligvis tilstrekkelig for en chirp prøve. Spinn cellene ved 800RCF for 4 min. Sug media og Resuspender 40 millioner celler i 40 ml PBS, kombinere rør om nødvendig. Spinn cellene ved 800RCF for 4 min. Dekanter PBS, forsiktig aspirer på en vinkel gjenværende væske. </ol> 3. Cross-link Cells og samle cellepelleten Kryssbindingsfordelingen samlet celler med glutaraldehyd å bevare RNA-Chromatin interaksjoner og forberede cellepelleten. Utfør alle trinnene ved romtemperatur. Forbered 1% glutaraldehyd i romtemperatur PBS. Forbered 10 ml per 10 millioner celler (0,4 ml 25% glutaraldehyd lager + 9,6 mL PBS). Glutaraldehyde må brukes fersk. Trykk bunnen av Falcon rør for å løsne pellets. Resuspender cellepelleten i 1% glutaraldehyd, starter med et lite volum for å unngå biter, deretter fylle opp til full volum. Inverter å blande. Kryssbindingsfordelingen for 10min ved romtemperatur på en ende-til-ende shaker eller rotator. Slukke kryssbinding reaksjon med 1/10th volum på 1,25 M glysin i romtemperatur i 5 min. Snurr på 2000RCF i 5 min. Aspirer supernatanten og vask pellet med 20 mL kjølt PBS gang, spinning på 2000RCF i 5 min. Aspirer og resuspender wforaskes, tverrbundet pellet med 1 ml kjølt PBS per 20 millioner celler. Overfør hver ml til en Eppendorf rør og spinn på 2000RCF for 3 min ved 4 C. Ta så mye PBS som mulig med pipettespissen nøye. Flash-fryse cellen pellets i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C på ubestemt tid. 4. Cellelyse Lyse krysskoblet celler til å forberede celle lysate. Tin frosne celle pellets ved romtemperatur. Trykk vanskelig å løsne og blande cellepelleten. Spinn ned pellet ved 2000RCF for 3 min ved 4 ° C. Bruk en skarp 10 mL pipette for å fjerne eventuelle gjenværende PBS. På en elektronisk balanse (nøyaktig til 1 mg) tara massen av en tom Eppendorf rør (våre rør veier 1.060 gram veldig konsekvent). Veie hver pellet og registrere sin vekt. En full 15 cm rett av tverrbundet Jakten celler veier vanligvis 100 mg. Supplement Lysis buffer (10X massen av pellets, en f.eks ml for 100 mg) med FRESh proteasehemmer, PMSF og Superase-i (se vedlagte buffer liste). Bland godt. Legg 10X volumet supplert Lysis Buffer til hvert rør og resuspender pelleten. For små pellets <25 mg, resuspender i 250 ml supplert lysis buffer. suspensjon skal være glatt. hvis ikke, dele suspensjonen 500 alikvoter og bruke en motorisert pellet mikser til å bryte opp klumper. fortsett straks sonikator. 5. sonikator shear dna ved sonicating krysskoblet celle lysates. sonicate lysate bioruptor 15 falcon rør. bruk <1,5 hvert rør, for raskere sonikator, ikke mer enn to rørene på gang. 4 ° c vannbad høyeste innstilling med 30 sekunder på, 45 av puls intervaller. sjekk min. inntil cellen lenger grumset. dette kan ta så lite som min mange fire timer. talletav vil prøvevolum, badet temperatur, perioden tid påvirke hvor lang prosessen tar. rør trolig ulike priser, pool dem sammen hver redistribuere inn originale sikre homogenitet. merk: glutaraldehyd-krysskoblet celler tar vesentlig lengre formaldehyd ekvivalenter. når snur klar, overføre 5 frisk eppendorf legg 90 protease k (pk) buffer (se liste) pk. vortex spinne mixe ned kort. inkuber 50 c. pakk qiagen pcr rensing kit. eluer eluering (eb) sjekke størrelse 1% agarose gel. dersom mesteparten smøre er 100-500 bp, fullført. fortsetter sonicate. sentrifuger sonicated prøver 16100rcf 10 kombiner supernatants, 1 flash-fryse flytende nitrogen. oppbevares -80 6. kvitre hybridize biotinylated prober rna isolere bundet kromatin. thaw kromatin romtemperatur. forbered hybridisering liste, forberede 2 per kromatin). blande. typisk prøve hjelp lysate, fjerne rna-inngang dna-inngang plass eppendorf-rør. hold is videre bruk. overfør tilsett total volum ml, tin nanodrop beløpet du har brukt det (100 mikrometer sondene skulle spec ~ 500-600 ng > skildrer chirp arbeidsflyten. En vellykket Chirp eksperiment beriker typisk target RNA betydelig over ikke-spesifikke RNA. Figur 2 viser anrikning av menneskelig telomerase RNA (TERC) fra Jakten celler enn GAPDH, et rikt cellulære RNA som fungerer som en negativ kontroll. Flertallet av TERC RNA (~ 88%) til stede i cellen ble dratt ned ved å utføre kvitre, mens bare 0,46% av GAPDH RNA ble hentet frem, viser en berikelse faktor på ~ 200 fold. Uspesifikke prober som prober rettet LacZ RNA, som ikke er uttrykt i pattedyrceller (figur 2), kan brukes som ekstra negative kontroller. DNA regioner forventes å binde målet lncRNA er typisk beriket enn negative regioner målt ved qPCR. Figur 3 viser qPCR validering av fire HOTAIR-bundet steder i primære humane foreskin fibroblaster at vi bestemt ved å utføre kvitre-seq i samme celle linje, mens TERC og GAPDH DNA-områder SErve som negativ kontroll regioner. Både "selv" og "odd" probe setter ga sammenlignbare anrikning av forventede HOTAIR-bundet områder enn negative regioner, et kjennetegn på ekte lncRNA-bindingssteder. High-throughput sekvensering av kvitre beriket DNA gir en global kart over lncRNA-bindingssteder. Den Drosophila lncRNA roX2 er kjent for å samhandle med X-kromosomet på en måte som er nødvendig for doseringen kompensasjon. Figur 4 viser roX2 binding profil over en del av X-kromosomet. Både "selv" og "rare" prøver har blitt sekvensert og deres unike lyder har blitt eliminert å produsere et spor av overlappende signaler. Hver "peak" indikerer her en sterk stedet roX2 bindende. Den komplette spor og liste over roX2 målgener har blitt beskrevet i Chu et al. 2011 17. Figur 1. Flow diagram av chirp proseDure. Kromatin er tverrbundet til lncRNA: protein-addukter i vivo Biotinylated fliser sonder er hybridisert å målrette lncRNA, og kromatin komplekser blir renset ved hjelp av magnetiske streptavidin perler, fulgt av strenge vasker.. Vi Eluer lncRNA bundet DNA eller proteiner med en cocktail av Rnase A og H. A antatte lncRNA bindende sekvensen er skjematisert i oransje. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17 Figur 2. Kvitre beriker for menneskelig TERC RNA. TERC-asDNA prober hente ~ 88% av mobilnettet TERC RNA og undetectable GAPDH. LacZ-asDNA prober brukes som negative kontroller og hente verken RNAS. Mean + sd vises. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17 Figur 3. HOTAIR kvitre-qPCR i primær menneskelig foreskin fibroblaster. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 og ABCA2 er regioner som samhandler med HOTAIR. TERC og GAPDH fungerte som negative kontroller. Mean + sd vises. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17 Figur 4. Kvitre-seq data av roX2 RNA i SL2 Drosophila celler. "Even" og "odd" ble sekvensert separat; sine data fusjonere å reflektere bare vanlige topper i begge. Det fusjonerte sporet vises. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17

Discussion

Her har vi beskrevet kvitre-seq, en metode for kartlegging in vivo lncRNA bindingssteder genom-wide. De viktigste parametrene for suksess er de delte bassenger av flislegging oligonukleotid prober og glutaraldehyd crosslinking. Utformingen av affinity-prober er grei gitt RNA sekvensen og krever ingen forkunnskaper i RNA struktur eller funksjonelle domener. Vår suksess med roX2, TERC, og HOTAIR – tre ganske forskjellige RNA i to arter – antyder at kvitre-seq er sannsynlig generalizable til mange lncRNAs. Som med alle eksperimenter, er omsorg og riktig kontroller er nødvendig for å tolke resultatene. Ulike lncRNA kan kreve titrering av forholdene, og klok endring av forhold som valg av forskjellige affinitet sonder eller crosslinkers, kan fremheve ulike aspekter av RNA-kromatin interaksjoner. Som Chip-seq, ikke alle bindende hendelser er nødvendigvis funksjonelle, og flere studier er nødvendig for å fastslå de biologiske konsekvensene av RNA occupancy på kromatin. Likevel, forutser vi mange interessante anvendelser av denne teknologien for forskere fra andre kromatin-tilknyttede lncRNAs, som nå nummer i tusenvis ^8,9. Akkurat som Chip-seq har åpnet døren for genom-wide undersøkelser av DNA-protein interaksjoner, kan kvitre-seq studier av den "RNA interactome" åpenbare mange nye muligheter for biologi.

Materials

Buffer List:

Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.

Lysis Buffer:

50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer (for DNA)

100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use

Hybridization Buffer

750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use

Wash Buffer

2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use

DNA elution Buffer

50 mM NaHCO3
1% SDS

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma Aldrich	G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer	VWR	V8185-904
Protease inhibitor	Roche	11873580001
PMSF	Sigma Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Falcon tubes (for sonication)	Corning	430790
Proteinase K	Ambion	AM2546
PCR purification kit	Qiagen	28106
C-1 magnetic beads	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma Aldrich	P7626-25G
DynaMag-15 magnet	Invitrogen	123-01D
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	123-21D
MIRNeasy mini kit	Qiagen	217004
Rnase H	Epicentre	R0601K
Rnase A	Sigma Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glycine	J.T. Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Elution Buffer (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
DNA-free	Ambion	AM1906
Buffer kit	Ambion	AM9010
Formamide	Invitrogen	15515-026