Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Summary

CHIRP är en ny och snabb teknik för att kartlägga genomiska bindningsställen långa icke-kodande RNA (lncRNAs). Metoden drar fördel av specificiteten för anti-sense tiling oligonukleotider för att möjliggöra en uppräkning av lncRNA bundna genomiska webbplatser.

Abstract

Långa icke-kodande RNA är viktiga regulatorer för kromatin staterna i viktiga biologiska processer såsom dosering kompensation, prägling och utvecklande genuttryck ^{1,2,3,4,5,6,7.} Den senaste upptäckten av tusentals lncRNAs i samband med specifika komplex kromatin ändringar, till exempel Polycomb repressiva komplex 2 (PRC2) som förmedlar histon H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) föreslår breda roller för många lncRNAs i hanteringen kromatin tillstånd i en gen-specifik fashion ^8,9. Medan vissa lncRNAs tros arbeta i cis på angränsande gener, andra lncRNAs arbeta i trans för att reglera avlägset belägna gener. Till exempel, Drosophila lncRNAs roX1 och roX2 binder många regioner på X-kromosomen av manliga celler och är avgörande för dosering skadestånd ^10,11. Emellertid är de exakta lägena för deras bindningsställen inte känt med hög upplösning. På samma sätt kan människor lncRNA HOTAIR påverkar PRC2 beläggningen på Hundreds av gener genomet hela ^3,12,13, men hur specificitet uppnås är oklart. LncRNAs kan också fungera som modulära ställningar att rekrytera montering av flera protein komplex. Den klassiska trans-verkande RNA ställningen är den TERC RNA som tjänar som templat och byggställning för telomeras komplex ^14; HOTAIR kan också tjäna som en byggnadsställning för PRC2 och en H3K4 demetylas komplex ^13.

Tidigare studier kartläggning RNA beläggning på kromatin har avslöjat stora insikter ^15,16, men bara på en enda gen locus åt gången. De beläggning platser i de flesta lncRNAs är inte kända, och de roller lncRNAs i kromatin förordningen har främst härledas från de indirekta effekterna av lncRNA störning. Precis som kromatin immunoprecipitation följt av microarray eller djup sekvensering (chip-chip eller Chip-punkter, respektive) avsevärt har förbättrat vår förståelse av protein-DNA interaktioner på en genomisk nivå, här illustrerar vi en recently publiceras strategi för att kartlägga lång RNA-beläggning Genomvid med hög upplösning ^17. Denna metod, Chromatin Isolering av RNA rening (CHIRP) (Figur 1), bygger på affinitetsinfångning av mål lncRNA: kromatin komplex med plattsättning antisense-oligonukleotider, som sedan genererar en karta över genomiska bindningsställen med en upplösning på flera hundra baser med hög känslighet och låg bakgrund. CHIRP är tillämplig på många lncRNAs eftersom utformningen av affinitets-prober är okomplicerad given RNA-sekvensen och kräver ingen kunskap om RNA: s struktur eller funktionella domäner.

Protocol

1. Probutformning Design anti-sense DNA plattsättning prober för selektiv hämtning av RNA målet med signalen. Design anti-sense oligo sonder som använder nätet sonden formgivare på singlemoleculefish.com 18. Använd dessa parametrar: antalet sönder = 1 sond / 100 bp av RNA längd, 2) Mål GC% = 45, 3) Oligonucleotide längd = 20, 4) avstånd längd = 60-80. Bryt RNA i segment om det för lång för konstruktören. Utelämna delar av upprepningar eller omfattande homologi. Ordningens anti-sens-DNA-sonder med BiotinTEG vid 3-prime änden. Markörprober enligt deras positioner längs RNA. Separera dem i två pooler så att "även" pool innehåller alla sonder numreringen 2, 4, 6, etc. och "udda" poolen innehåller sonder numrering 1, 3, 5, etc. Späd pool av sönder till 100 iM koncentration och Förvara vid -20 ° C. Alla experiment som skall utföras med användning avbåde pooler, som fungerar som interna kontroller för varandra. Real RNA-beroende signal skulle finnas från båda pooler, medan prob-specifika ljud skulle vara unik för varje pool. Detta gäller för både CHIRP-qPCR och kvittra-punkter. 2. Harvest celler Samla celler som kommer att användas för CHIRP experiment. Odla celler i plattor för vävnadsodling eller kolvar till sammanflytning. Skölj med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) en gång och Trypsinisera. Släck trypsin med> 2x volym media, pipett upp och ner att få bort celler och slamma i enkelcellsuspension. Överför alla medier och suspenderades celler i 50 ml Falcon rör. 20 miljoner celler är typiskt tillräckligt för en CHIRP prov. Snurra celler vid 800RCF under 4 min. Aspirera medier och återsuspendera 40 miljoner celler i 40 ml PBS, kombinera rör vid behov. Snurra celler vid 800RCF under 4 min. Dekantera PBS försiktigt aspirera på en vinkel kvarvarande vätska. </ol> 3. Cross-link celler och samla cellpelleten Tvärbinder samlas celler med glutaraldehyd för att bevara RNA-kromatin interaktioner och förbereda cellpellet. Utför alla steg vid rumstemperatur. Framställ 1% glutaraldehyd i rumstemperatur PBS. Framställ 10 ml per 10 miljoner celler (0,4 ml 25% glutaraldehyd lager + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyd måste användas färsk. Knacka botten Falcon-rör för att avlägsna pellets. Återsuspendera cellpelleten i 1% glutaraldehyd, börjar med en liten volym för att undvika bitar, sedan uppifrån upp till full volym. Vänd för att blanda. Tvärbinda under 10 minuter vid rumstemperatur på en ände-till-ände-skakare eller rotator. Quencha tvärbindningsreaktionen med 1/10-del volym av 1,25 M glycin vid rumstemperatur under 5 minuter. Snurra med 2000RCF under 5 min. Aspirera supernatanten och tvätta pelleten med 20 ml kyld PBS gång, spinning vid 2000RCF under 5 min. Aspirera och resuspendera Wföraskas, tvärbunden pellet med 1 ml kyld PBS per 20 miljoner celler. Överföra varje ml av en Eppendorf-rör och centrifugera vid 2000RCF under 3 min vid 4 C. Avlägsna så mycket PBS som möjligt med pipettspetsen noggrant. Flash-frysa cellpelletarna i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C tills vidare. 4. Cellys Lyse tvärbundna celler för att förbereda cellysatet. Tina frysta cellpelleterna vid rumstemperatur. Knacka svårt att lösgöra och blanda cellpelleten. Centrifugera ner pelleten vid 2000RCF under 3 min vid 4 ° C. Använda en skarp 10 mikroliter pipettspets för att avlägsna eventuellt återstående PBS. På en elektronisk våg (noggrannhet 1 mg) taran massan av en tomt Eppendorf-rör (våra rör väger 1.060 gram väldigt konsekvent). Väg varje pellet och registrera sin vikt. En fullständig 15 cm skål med tvärbunden HeLa-celler väger vanligtvis 100 mg. Tillägg lyseringsbuffert (10X massa pellets, t.ex. 1 ml för 100 mg) med Fresh proteashämmare, PMSF och Superase-in (se bifogad buffert lista). Blanda väl. Lägg 10X volymen kompletteras lyseringsbuffert till varje rör och suspendera pelleten. För små pellets <25 mg, resuspendera i 250 kompletteras fil lysbuffert. suspensionen bör vara släta. om inte, dela 500 alikvoter och använda en motoriserad pellet mixer för att bryta upp klumpar. fortsätt omedelbart ultraljudsbehandling. 5. sonikering shear dna genom tvärbundna cellysat. sonikera cellysat bioruptor 15 ml falcon-rör. <1,5 lysat varje rör, snabbare sonikering, inte mer än två rören vid tidpunkt. 4 ° c vattenbad högsta inställningen med 30 sekunder på, 45 av pulsintervall. ta lysatet var min. fortsätta tills cellysatet längre grumlig. det kan så lite som minuter många timmar. antaletav kommer prowolymen, badtemperaturen, perioden sonikeringstid påverka hur länge den tar. rör sannolikt olika takt, slår samman dem tillsammans min omfördela till originalskick säkerställa homogenitet. obs: glutaraldehyd-tvärbunden cellerna betydligt tid formaldehyd motsvarigheter. när blir klar, överföra 5 il ett nytt eppendorf-rör. lägg 90 pl proteas k (pk) buffert (se lista) pk. vortex blanda spinn ner kort stund. inkubera under 50 c. extrahera qiagen pcr rening kit. eluerar | elueringsbuffert (eb) kontrollera dna-storlek på 1% agarosgel. huvuddelen utstryket är 100-500 bp, klar. fortsätter sonikera. centrifugera sonikerade proverna 16100rcf 10 kombinera supernatanterna alikvot 1 prover flash-frysa flytande nitrogen. lagra -80 6. pip hybridisera biotinylerade dna-sonder rna isolera bunden kromatin. tina kromatin rumstemperatur. förbered hybridiseringsbuffert buffertlistan, förbereda 2 per kromatin). virvel blanda. typisk chirp prov användning lysat, avlägsna input dna-input placera håll is vidare användning. Överför falcon rör. tillsätt hybridisering total volym ml, använd eppendorf prober nanodrop sönder beloppet du har använt lång (100 im spec ~ 500-600 ng > visar CHIRP arbetsflödet. En framgångsrik CHIRP experimentet berikar typiskt mål-RNA signifikant över icke-specifika RNA-sekvenser. Figur 2 visar anrikning av humant telomeras-RNA (TERC) från HeLa-celler under GAPDH, en riklig cellulärt RNA som fungerar som en negativ kontroll. Majoriteten av TERC RNA (~ 88%) som finns i cellen revs genom att utföra kvittra, medan endast 0,46% av GAPDH RNA hämtades, visar en anrikning faktor ~ 200 gånger. Ospecifika prober såsom prober riktade LacZ-RNA, som inte uttrycks i däggdjursceller (fig. 2), kan användas som ytterligare negativa kontroller. DNA-regioner som förväntas binda till mål-lncRNA typiskt anrikade över negativa regioner när den mäts med qPCR. Visar qPCR validering av fyra HOTAIR-bundna ställen i primära humana förhudsfibroblaster att vi bestämdes genom att utföra CHIRP-punkter i samma cellinje Figur 3, medan TERC och GAPDH-DNA ställen sigrve som negativa kontroll regioner. Både "även" och "udda" probe sätter gav jämförbara anrikning av förväntade HOTAIR-bundna ställen över negativa regioner, ett kännetecken för äkta lncRNA-bindningsställen. Hög kapacitet sekvensering av CHIRP berikat DNA ger en global karta över lncRNA-bindningsställen. Drosophila lncRNA roX2 är känt för att interagera med X-kromosomen på ett sätt som krävs för dosering kompensation. Figur 4 visar roX2 bindningsprofil över en sektion av X-kromosomen. Både "även" och "udda" prover har sekvenserats och deras unika ljud har eliminerats för att producera ett spår av överlappande signaler. Varje "topp" anger här en stark plats roX2 bindande. Den kompletta spår och lista över roX2 målgener har beskrivits i Chu et al. 2011 17. Figur 1. Flödesschema av CHIRP förfarandet. Kromatin är tvärbunden till lncRNA: proteinaddukter in vivo hybridiseras till målet lncRNA Biotinylerade plattsättning prober, och kromatin komplex renas med användning av magnetiska streptavidinpärlor, följt av stringenta tvättar.. Vi eluera lncRNA bundet DNA eller proteiner med en cocktail av RNas A och H. En förmodad lncRNA bindande sekvens schematiseras i orange. Tidigare publicerad i Chu et al. 2011 17. Figur 2. Chirp berikar för människor TERC RNA. TERC-asDNA sonder hämta ~ 88% av cellulära TERC RNA och omöjlig att upptäcka GAPDH. LacZ-asDNA prober används som negativa kontroller och hämta varken RNA. Medelvärde + SD visas. Tidigare publicerad i Chu et al. 2011 17. Figur 3. HOTAIR CHIRP-qPCR i primär människa förEskin fibroblaster. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 och ABCA2 är regioner som interagerar med HOTAIR. TERC och GAPDH tjänade som negativa kontroller. Medelvärde + SD visas. Tidigare publicerad i Chu et al. 2011 17. Figur 4. CHIRP-artiklar uppgifter om roX2 RNA i SL2 Drosophila celler. "Även" och "udda" sekvensbestämdes separat, sina data samman för att spegla bara vanliga toppar i båda. Den sammanslagna spåret visas. Tidigare publicerad i Chu et al. 2011 17.

Discussion

Här har vi beskrivit CHIRP-punkter, en metod för kartläggning in vivo lncRNA bindningsställen genomet över. De viktigaste parametrarna för att lyckas är de delade poolerna av kakel oligonukleotidprober och glutaraldehyd tvärbindning. Utformningen av affinitets-prober är okomplicerad given RNA-sekvensen och inte kräver någon tidigare kännedom om RNA: s struktur eller funktionella domäner. Vår framgång med roX2, TERC och HOTAIR – tre ganska olika RNA i två arter – tyder på att CHIRP-artiklar är sannolikt generaliserbara för många lncRNAs. Som med alla experiment, är vård och ordentliga kontroller som krävs för att tolka resultaten. Olika lncRNA kan kräva titrering av förutsättningar och förnuftig förändring av villkor, såsom val av olika affinitet prober eller tvärbindningsmedel kan belysa olika aspekter av RNA-kromatin interaktioner. Liksom Chip-punkter, inte alla bindande evenemang nödvändigtvis funktionella, och ytterligare studier krävs för att kontrollera de biologiska konsekvenserna av RNA occupancy på kromatin. Ändå ser vi många intressanta tillämpningar av denna teknik för forskare från andra kromatin-associerade lncRNAs, som nu nummer i tusental ^8,9. Precis som Chip-punkter har öppnat dörren för genomet hela utforskning av DNA-protein interaktioner kan CHIRP-Seq studier av "RNA interactome" avslöjar många nya vägar för biologi.

Materials

Buffer List:

Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.

Lysis Buffer:

50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer (for DNA)

100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use

Hybridization Buffer

750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use

Wash Buffer

2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use

DNA elution Buffer

50 mM NaHCO3
1% SDS

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma Aldrich	G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer	VWR	V8185-904
Protease inhibitor	Roche	11873580001
PMSF	Sigma Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Falcon tubes (for sonication)	Corning	430790
Proteinase K	Ambion	AM2546
PCR purification kit	Qiagen	28106
C-1 magnetic beads	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma Aldrich	P7626-25G
DynaMag-15 magnet	Invitrogen	123-01D
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	123-21D
MIRNeasy mini kit	Qiagen	217004
Rnase H	Epicentre	R0601K
Rnase A	Sigma Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glycine	J.T. Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Elution Buffer (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
DNA-free	Ambion	AM1906
Buffer kit	Ambion	AM9010
Formamide	Invitrogen	15515-026