La α-test: Rapid cell-free CD4 Enumeration Uso Saliva Whole

Summary

Un metodo enumerazione CD4, la α-test, viene descritto che utilizza saliva intera per fornire rapidi e precisi conta di CD4. Le α-test centesimi i costi ed elimina la necessità di una formazione tecnica, reagenti costosi come gli anticorpi monoclonali, strumentazione, refrigerazione, trasporto dei campioni, nonché di raccolta e trattamento del sangue.

Abstract

Vi è un urgente bisogno di conteggio CD4 a prezzi accessibili per monitorare la malattia da HIV. Conteggio CD4 è fuori portata nelle regioni a causa del tempo e le limitazioni di temperatura, sofisticazione tecnica, e il costo dei reagenti risorse limitate, in particolare per misurare gli anticorpi monoclonali CD4 sulle cellule del sangue, l'unico metodo attualmente accettabile. Un laboratorio comunemente utilizzati risparmio di costi e risparmio di tempo strategia è quella di calcolare, piuttosto che i valori ematici certa misura. Per esempio, livelli di LDL sono calcolati utilizzando i livelli misurati di colesterolo totale, HDL, e trigliceridi ^1. Pertanto, l'identificazione di cellule libere correlati che regolano direttamente il numero di cellule T CD4 ⁺ potrebbe fornire un metodo preciso per calcolare CD4 per l'importanza fisiologica dei correlati.

Il numero di cellule staminali che entrano sangue e sono destinate a diventare circolanti cellule CD4 ⁺ T è determinata dalla chemiochina uno CXCL12nd suo recettore CXCR4 per la loro influenza sulla locomozione ^2. Il processo di locomozione di cellule staminali nel sangue viene ulteriormente regolata dalla cellula umana superficie dei leucociti elastasi (HLE _CS) e la _CS-reattivo HLE attivo α ₁ inibitore della proteinasi (α ₁ PI, α ₁ antitripsina, SerpinA1) ^3. In malattia da HIV-1, α ₁ PI è inattivato a causa di processi patologici ^4. Nei primi categorie asintomatici di HIV-1 malattia, attiva α ₁ PI è risultata inferiore normale in 100% di non trattati pazienti HIV-1 (mediana = 12 pM, e per ottenere livelli normali durante le categorie sintomatici ^{4, 5.} Questo modello è stata attribuita a inattivazione immune, non alla sintesi insufficiente, inattivazione proteolitica, o ossigenazione. Abbiamo osservato che in HIV-1 soggetti con> 220 cellule CD4 / microlitro, CD4 sono stati correlati con i livelli sierici di accesso α ₁ PI (r ² = 0.93, p &lt; 0.0001, n = 26) e gli inattivi α ₁ PI (r ² = 0.91, p <0.0001, n = 26) ^5. La somministrazione di α ₁ PI per HIV-1 i soggetti infetti e non infetti portato a un drastico incremento nella conta dei CD4 suggeriscono α ₁ PI partecipa alla regolazione del numero di cellule T CD4 ⁺ nel sangue ^3.

Con la stimolazione, la saliva contiene tutto sufficiente essudato sieroso (plasma contenente materiale proteico che passa attraverso le pareti dei vasi sanguigni nella saliva) per consentire la misurazione delle attività α ₁ PI e la correlazione di questa misura è la prova che si tratta di un metodo preciso per calcolare il numero di CD4. Brevemente, sialogogues come gomma da masticare o acido citrico stimolare l'essudazione di siero in saliva intera bocca. Dopo stimolando essudazione siero, l'attività di siero α ₁ PI in saliva è misurata dalla sua capacità di inibire l'attività elastasi. Suina elastasi pancreatica (PPE)è facilmente disponibile una fonte economica di elastasi. PPE lega α ₁ PI formando uno-a-uno complesso che impedisce PPE di scindere i suoi substrati specifici, uno dei quali è il peptide colorimetriche, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA ³ NA). Incubazione saliva con una concentrazione di saturazione di PPE per 10 min a temperatura ambiente consente il legame di PPE a tutti attivo α ₁ PI nella saliva. L'inibizione di PPE risultante dalla attivo α ₁ PI può essere misurata aggiungendo il substrato PPE SA ³ NA. (Figura 1). Sebbene CD4 sono misurate in termini di volume di sangue (cellule CD4 / pl), la concentrazione di α ₁ PI nella saliva è correlata alla concentrazione di siero in saliva, non al volume di saliva dal volume può variare notevolmente durante il giorno e persona a persona ^6. Tuttavia, quasi tutte le proteine ​​nella saliva è dovuto al contenuto di siero, e il contenuto di proteine ​​della saliva è measurable ^7. Così, attivo α ₁ PI in saliva viene calcolato come rapporto al contenuto proteico e saliva viene chiamata α ₁ Index PI. I risultati qui presentati dimostrano che la α ₁ Index PI fornisce un metodo accurato e preciso fisiologico per il calcolo CD4.

Protocol

1. Preparare freschi soluzioni di lavoro TBS: 0,05 M Tris Buffered Saline, pH 7.8 (TBS). Preparare 60 ml TBS / micropiastra. PPE: elastasi pancreatica suina, di tipo 1 (PPE) viene fornito come sospensione. Agitare bene e diluire DPI in TBS a circa 0,01 U / ml. Preparare 6 ml soluzione di lavoro / micropiastra). SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Preparare 0,1 M magazzino SA 3 solu…

Discussion

Non diluito siero contiene mediana 36 uM α ₁ PI e 3,6 uM α ₂ macroglobulina (α ₂ M) una differenza di 10 volte ^8. Entrambe le proteine ​​competono per il legame ai DPI. Queste due caratteristiche, concentrazione e PPE affinità, sono stati sfruttati per sviluppare un metodo che sia in grado di misurare specificamente α ₁ PI nel siero normale in presenza di competere α ₂ M ^8. Questo metodo in grado di rilevare un minimo di 50 μ nM <sub…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sialogogue, 0.05M citric acid	Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Sugar-Free Lemon dropS
Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Tissue culture-treated, 96 well microplates	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
Microplate Reader with filters for 405 nm and 595 nm	MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182	Dynex P97277