O α-teste: Rapid livre de células CD4 enumeração Utilizando saliva total

Summary

Um método de enumeração de células CD4, o α-teste, é descrito que utiliza saliva total para fornecer contagens de CD4 rápidos e precisos. As α-teste tostões custos e elimina a necessidade de formação técnica, reagentes caros, tais como anticorpos monoclonais, instrumentação, refrigeração, transporte de amostras, bem como coleta e manuseio de sangue.

Abstract

Há uma necessidade urgente de enumeração CD4 acessível para monitorar a doença HIV. Enumeração de CD4 está fora de alcance em regiões com recursos limitados, devido ao tempo e as restrições de temperatura, a sofisticação técnica e custo dos reagentes, em particular anticorpos monoclonais para medir o CD4 nas células sanguíneas, o único método atualmente aceitável. Uma estratégia comumente utilizada laboratório de economia de custos e economia de tempo é de calcular, em vez de valores de medidas determinadas no sangue. Por exemplo, os níveis de LDL são calculados usando os níveis medidos de colesterol total, HDL e triglicéridos ^1. Assim, a identificação de células livres que se correlaciona directamente regulam o número de células T CD4 ⁺ poderiam fornecer um método preciso para calcular contagem de células CD4, devido à relevância fisiológica dos correlatos.

O número de células estaminais que entram no sangue e destinam-se a tornar-se circular ^células T CD4 + é determinado pelo quimiocina CXCL12 umnd seu receptor CXCR4 devido à sua influência sobre a locomoção ^2. O processo de locomoção de células estaminais no sangue é adicionalmente regulada por superfície celular leucocitário humano elastase (HLE _CS) e da HLE _CS-reactivo activo α ₁ inibidor de protease (α ₁ PI, α ₁ antitripsina, SERPINA1) ^3. Em HIV-1 da doença, α ₁ PI é inactivado devido a processos de doença ^4. Nas categorias iniciais assintomáticos de HIV-1 da doença, activa α ₁ PI foi encontrado para ser abaixo do normal em 100% de HIV-1 não tratados (doentes mediana = 12 uM, e para conseguir os níveis normais durante as categorias sintomáticos ^{4, 5.} Este padrão tem sido atribuído à inactivação imunitário, não para a síntese insuficiente, a inactivação proteolítica, ou oxigenação. Observou-se que em HIV-1 indivíduos com> 220 CD4 células / uL, as contagens de CD4 foram correlacionados com os níveis séricos de activa α ₁ PI (r ² = 0,93, p &lt; 0,0001, n = 26) e inativos α ₁ PI (r ² = 0,91, p <0,0001, n = 26) ^5. A administração de α ₁ PI ao HIV-1 indivíduos infectados e não infectados resultou em aumentos dramáticos na contagem de CD4, sugerindo α ₁ PI participa na regulação do número de células T CD4 ⁺ no sangue ^3.

Com a estimulação, a saliva contém todo exsudato seroso suficiente (plasma contendo material proteináceo que passa através das paredes dos vasos sanguíneos na saliva) para permitir a medição de ativos α ₁ PI ea correlação dessa medida é prova de que é um método preciso para calcular os valores de CD4. Resumidamente, sialogogues tais como goma de mascar ou ácido cítrico estimular a exsudação de soro na saliva boca inteira. Depois de estimular a exsudação de soro, a actividade de soro α ₁ PI na saliva é medido pela sua capacidade para inibir a actividade da elastase. Pâncreas suíno elastase (PPE)é uma fonte facilmente disponível barato de elastase. PPE liga-se a α ₁ PI formação de um complexo um-para-um que impede PPE de clivar os seus substratos específicos, um dos quais é o péptido colorimétricas, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA ³ NA). A incubação de saliva com uma concentração saturante de EPI durante 10 min à temperatura ambiente permite a ligação de PPE para todas activas α a ₁ PI na saliva. A inibição resultante de EPI por activo α ₁ PI pode ser medido através da adição do substrato PPE SA ³ NA. (Figura 1). Embora as contagens de CD4 são medidos em termos de volume de sangue (CD4 células / mL), a concentração de α PI ₁ na saliva está relacionado com a concentração de soro na saliva, não a um volume de saliva desde que o volume pode variar consideravelmente durante o dia, por pessoa para pessoa ^6. No entanto, virtualmente toda a proteína na saliva é devido ao teor de soro, eo teor de proteína de saliva é MEAmensuráveis ^​​7. Assim, activa α ₁ PI na saliva é calculada como uma razão para o conteúdo de proteína saliva e é denominado o α ₁ Índice PI. Os resultados apresentados aqui demonstram que o Índice de α ₁ PI fornece um método exacta e precisa fisiológica para calcular os valores de CD4.

Protocol

1. Prepare frescos Soluções de Trabalho TBS: 0,05 M de Tris pH tamponada, solução salina 7,8 (TBS). Preparar 60 ml de TBS / microplaca. PPE: elastase pancreática porcina, tipo 1 (PPE) é fornecida como uma suspensão. Agitar bem e diluir PPE em TBS a cerca de 0,01 U / ml. Preparar 6 ml de solução de trabalho / microplaca). SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Preparar 0,1 M estoque SA <…

Discussion

Soro não diluído contém 36 mM mediana α ₁ PI e 3,6 mM α macroglobulina ₂ (α ₂ M) uma diferença de 10 vezes ^8. Ambas as proteínas competir para a ligação a PPE. Estas duas características, concentração e PPE afinidade, têm sido exploradas para desenvolver um método que é capaz de medir especificamente α ₁ PI no soro normal na presença de competir α ₂ M ^8. Este método pode detectar tão pouco como 50 nM μ ₁ PI no s…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sialogogue, 0.05M citric acid	Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Sugar-Free Lemon dropS
Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Tissue culture-treated, 96 well microplates	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
Microplate Reader with filters for 405 nm and 595 nm	MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182	Dynex P97277