وحيد الطفرات سيت بيسلفيت
Summary
الطفرات بيسلفيت هو معيار الذهب لتحليل الحامض النووي. لدينا بروتوكول تعديل يسمح لتحليل الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية والتي صممت خصيصا لالبويضات الفردية. ويمكن أيضا استخدامه لانشقاق في مرحلة الأجنة.
Abstract
علم التخلق يتفرد بها كل الموروثة وتعديلات عكسها على لونين من شأنها أن تغير الجينات إمكانية الوصول، وبالتالي هي الآليات الأساسية لتنظيم النسخ الجيني 1. الحامض النووي هو تعديل اللاجينية التي تعمل في الغالب على أنه علامة القمعية. من خلال إضافة التساهمية لمجموعة الميثيل على cytosines في dinucleotides الدليل السياسي الشامل، فإنه يمكن توظيف البروتينات القمعية إضافية وتعديلات بسيطة لبدء العمليات التي ينطوي عليها التكثيف لونين وإسكات الجينات 2. الحامض النووي أمر ضروري للتطور الطبيعي لأنه يلعب دورا حاسما في البرمجة التنموية، تمايز الخلايا، وقمع العناصر فيروسات، تعطيل كروموسوم X-والبصمة الجينية.
واحدة من أكثر الوسائل قوية لتحليل الحامض النووي هو الطفرات بيسلفيت. بيسلفيت الصوديوم هو المغير الحمض النووي التي deaminates cytosines إلى uracils. بعد التضخيم PCR وseque ncing، تم الكشف عن هذه الأحداث تحويل كما thymines. محمية cytosines ميثليته من نزع الأمين وهكذا تظل كما cytosines، مما يتيح تحديد الحامض النووي على مستوى فردي النوكليوتيدات 3. وقد تقدمت تطوير بيسلفيت فحص الطفرات من تلك التي ذكرت في الأصل 4-6 نحو تلك التي هي أكثر حساسية وقابلية للتكرار 7. وكان واحد تقدم مفتاح تضمين كميات صغيرة من الحمض النووي في حبة الاغاروز، ومن ثم حماية الحمض النووي من معاملة قاسية بيسلفيت 8. إلى أن يتم تنفيذ هذا التحليل مثيلة تمكين على برك من البويضات والأجنة في مرحلة الكيسة 9. والطفرات بيسلفيت الأكثر تطورا حتى الآن هو بروتوكول للأجنة في مرحلة الكيسة فرد 10. ومع ذلك، منذ blastocysts يكون على الخلايا متوسط 64 (التي تحتوي على 120-720 خريج من الحمض النووي الجيني)، وهذا الأسلوب غير فعال للدراسات مثيلة في البويضات أو الأجنة الفردية الانقسام المرحلة.
خيمة "> أخذ القرائن من تضمين الاغاروز كميات الحمض النووي بما في ذلك البويضات الدقيقة 11، هنا نقدم وسيلة يتم من خلالها مباشرة جزءا لا يتجزأ من البويضات في الاغاروز وتحلل حبة حل استرجاع التالية فورا وإزالة الشفافة زونا من البويضة، وهذا يتيح لنا تجاوز التحديات الرئيسيان من بويضة واحدة الطفرات بيسلفيت: حماية كمية ضئيلة من الحمض النووي من تدهور، وفقدان لاحق خلال خطوات عديدة بروتوكول الأهم من ذلك، كما يتم الحصول على البيانات من البويضات واحد، هو القضاء مسألة التحيز PCR داخل حمامات وعلاوة على ذلك. ، غير مقصود تلوث الخلية الركامية قابلا للاكتشاف من قبل هذه الطريقة منذ يجوز استبعاد أي عينة مع نمط مثلأيشن واحد أو أكثر من تحليل 12. هذا البروتوكول يوفر طريقة أفضل للتحليل ناجحة وقابلة للتكرار من الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية، ويعتبر مثاليا لالبويضات الفردية، وكذلك الأجنة في مرحلة الانقسام.Protocol
Discussion
هذا الفحص بويضة واحدة تحتوي على العديد من الخطوات مع عدد التي تعتبر بالغة الأهمية وتتطلب رعاية خاصة. الأول هو غسل البويضة. من المهم بشكل خاص لغسل كل بويضة عدة مرات في المتوسط الطازجة يسقط بعد العلاج هيالورونيداز لإزالة الركام وخلايا أكبر عدد ممكن. وعلاوة على ذلك، ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جامعة ويسترن اونتاريو، وقسم التوليد وأمراض النساء، ومنحة ER06-02-188 من البحوث Ministryof والابتكار، في وقت مبكر جائزة الباحث. وأيدت الاحزاب من قبل برنامج التدريب CIHR في التكاثر، والتنمية في وقت مبكر وتأثير ذلك على الصحة منحة دراسات عليا (REDIH).
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
Riferimenti
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l. Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
