Summary
Mutagênese bissulfito é o padrão ouro para a análise de metilação do DNA. Nosso protocolo modificado permite a análise de metilação do DNA ao nível de uma única célula e foi projetado especificamente para oócitos individuais. Também pode ser utilizado para a clivagem do estágio-embriões.
Abstract
Epigenética engloba todas hereditárias e modificações reversíveis de cromatina que alter acessibilidade gene e, portanto, são os principais mecanismos de regulação da transcrição do gene 1. Metilação do DNA é uma modificação epigenética, que atua predominantemente como uma marca repressiva. Através da adição covalente de um grupo metilo em citosinas na dinucleótidos CpG, pode recrutar adicionais proteínas repressores e modificações histona para iniciar processos envolvidos na condensação da cromatina e silenciamento de genes 2. Metilação do DNA é essencial para o desenvolvimento normal, pois desempenha um papel fundamental na programação do desenvolvimento, diferenciação celular, a repressão de elementos retrovirais, inativação do cromossomo X e imprinting genômico.
Um dos métodos mais poderosos para a análise de metilação de DNA é a mutagénese bissulfito. Bissulfito de sódio é um agente mutagénico DNA que deaminates citosinas em uracilos. Após amplificação por PCR e Seque ncing, estes eventos de conversão são detectados como timinas. Citosinas metiladas são protegidos de desaminação e, assim, permanecer como citosinas, permitindo a identificação de metilação de ADN a nível individual de nucleótidos 3. Desenvolvimento da mutagênese bissulfito avançou daqueles originalmente informados 4-6 para aqueles que são mais sensíveis e reprodutíveis 7. Um avanço chave foi a incorporação de pequenas quantidades de DNA em um grânulo de agarose, protegendo assim o DNA a partir do tratamento com bissulfito dura 8. Esta análise de metilação habilitado a ser realizada em piscinas de oócitos e embriões em estágio de blastocisto 9. O protocolo de mutagênese mais sofisticado bissulfito de data é para cada estágio de blastocisto-embriões 10. No entanto, uma vez que os blastocistos têm, em média 64 células (contendo 120-720 pg de DNA genómico), este método não é eficaz para os estudos de metilação em oócitos individuais ou de clivagem-stage embriões.
tenda "> Tomar pistas de agarose incorporação de quantidades de DNA minutos, incluindo oócitos 11, aqui apresentamos um método pelo qual os oócitos são diretamente incorporado em um agarose e solução de lise talão de recuperação imediatamente a seguir e remoção da zona pelúcida do ovócito. Isso nos permite ignorar os dois principais desafios da mutagénese único oócito bissulfito:. protectores uma pequena quantidade de DNA a partir de degradação, e subsequente perda durante os passos do protocolo numerosas importante, como os dados são obtidos a partir de oócitos individuais, a questão da PCR viés dentro piscinas é eliminado Além disso. , a contaminação de células do cumulus inadvertida é detectável por este método uma vez que qualquer amostra com mais do que um padrão de metilação pode ser excluídos da análise 12. Este protocolo fornece um método melhorado para análises de sucesso e reprodutível de metilação do DNA ao nível de uma única célula e é idealmente adequado para oócitos individuais, bem como estágios de clivagem dos embriões.Protocol
Discussion
Este ensaio único óvulo contém muitas etapas com um número que são críticas e requerem cuidados especiais. A primeira é a lavagem do oócito. É particularmente importante para lavar cada oócito várias vezes em meio fresco cai após o tratamento hialuronidase para remover as células do cumulus tantas quanto possível. Além disso, quando a transferência de ovócitos a solução ácida de Tyrode para zona pelúcida remoção certifique-se envolvente meio é claro de células do cumulus. O oócito é muito pega…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Universidade de Western Ontario, no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, e uma bolsa ER06-02-188 a partir da Pesquisa MINISTÉRIO e Inovação, Prêmio Pesquisador precoce. MMD foi apoiada por um programa de treinamento CIHR em Reprodução, Desenvolvimento precoce eo Impacto na Saúde Bolsas de Pós-Graduação (REDIH).
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
Riferimenti
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l. Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
