ביצית אחת bisulfite mutagenesis
Summary
Mutagenesis bisulfite הוא תקן הזהב לניתוח מתילציה בדנ"א. פרוטוקול שונה שלנו מאפשרת ניתוח מתילציה דנ"א ברמת מתחיל מתא בודד ותוכנן במיוחד עבור ביציות נפרדות. זה יכול לשמש גם המחשוף בשלב עוברי.
Abstract
אפיגנטיקה מקיפה את כל תורשתי ושינויים הפיך כדי הכרומטין כי הנגישות אלתר הגן, וכך הם המנגנונים העיקריים בוויסות שעתוק הגנים 1. מתילציה DNA הוא שינוי epigenetic שפועל בעיקר כסימן הדיכוי. באמצעות תוספת קוולנטי של קבוצת מתיל על cytosines ב dinucleotides CPG, הוא יכול לגייס חלבונים דיכוי נוספים ושינויים היסטון ליזום תהליכים המעורבים עיבוי הכרומטין השתקת גנים 2. מתילציה דנ"א חיוני להתפתחות נורמלית כפי שהיא משחקת תפקיד קריטי תכנות התפתחותי, התמיינות תאים, הדיכוי של אלמנטים retroviral, כרומוזום ה-X איון ו החתמה גנומית.
אחת השיטות החזקות ביותר לניתוח מתילציה בדנ"א הוא mutagenesis bisulfite. Bisulfite נתרן הוא mutagen דנ"א deaminates cytosines אל uracils. בעקבות הגברה seque PCR ו ncing, אירועים אלה המרה מזוהים כמו thymines. Cytosines מפוגל מוגנים מפני deamination ובכך להישאר cytosines, המאפשר זיהוי של מתילציה בדנ"א ברמת נוקלאוטיד יחיד 3. פיתוח assay mutagenesis bisulfite התקדמה מאלה דווח במקור 4-6 כלפי אלה הרגישים יותר לשחזור 7. אחד היה המפתח להתקדמות הטמעת כמויות קטנות יותר של דנ"א חרוז agarose, ובכך להגן על ה-DNA מטיפול bisulfite הקשה 8. ניתוח זה מתילציה מופעל להתבצע על בריכות של ביציות ו בשלב הבלסטוציסט ועוברים 9. Mutagenesis המתוחכמת ביותר bisulfite פרוטוקול עד כה היא בשלב הבלסטוציסט עוברים בודדים 10. עם זאת, מאז blastocysts יש על 64 תאים הממוצע (המכיל 120-720 PG של הדנ"א הגנומי), שיטה זו אינה יעילה ללימודי מתילציה על ביציות בודדים או מחשוף בשלב עוברים.
אוהל "> לוקח רמזים מן הטבעה agarose כמויות הדנ"א דקות כולל 11 ביציות, כאן אנו מציגים שיטה לפיה ביציות מוטבעים ישירות agarose ו תמוגה פתרון חרוז אחזור מיד לאחר והסרה של pellucida Zona מן הביצית. זה מאפשר לנו לעקוף את שני האתגרים העיקריים של mutagenesis ביצית אחת: bisulfite. המגנים על כמות זעירה של דנ"א, השפלה ואובדן הבאים במהלך השלבים פרוטוקול רבים חשוב לציין, כאשר הנתונים מתקבלים ביציות בודדות, סוגיית ההטיה PCR בתוך בריכות מסולק יתר על כן. , זיהום מכוונת התא תלולית ניתן לזהות על ידי שיטה זו שכן כל המדגם עם דגם אחד או יותר של מתילציה ניתן נכללו בניתוח 12. פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור ניתוחים מוצלחים לשעתקו של מתילציה בדנ"א ברמת מתחיל מתא בודד והוא אידיאלי עבור ביציות נפרדות, כמו גם מחשוף בשלב עוברים.Protocol
Discussion
זה assay ביצית אחת מכיל שלבים רבים עם מספר כי הם קריטיים ודורשים טיפול מיוחד. הראשונה היא שטיפת הביצית. זה חשוב במיוחד כדי לשטוף כל הביצית מספר פעמים בינוני טרי טיפות לאחר הטיפול hyaluronidase כדי להסיר תאים קומולוס רבים ככל האפשר. יתר על כן, בעת העברת ביציות לפתרון חומצי של tyrod…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מערב אונטריו, החוג למיילדות וגינקולוגיה, ומענק ER06-02-188 מהמחקר Ministryof וחדשנות, פרס חוקר הקדומה. אכפת נתמך על ידי תוכנית אימון CIHR ב שכפול, בהתפתחות המוקדמת ואת ההשפעה על מלגה (REDIH) בוגר הבריאות.
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
Riferimenti
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l. Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
