جيل من صنع الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة الدموية المحيطية باستخدام Lentiviral STEMCCA المتجهات
Summary
هنا نعرض بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد iPSCs الإنسان من مل 3-4 من الدم المحيطي واحد باستخدام ناقلات lentiviral إعادة برمجة. إعادة برمجة خلايا الدم متاحة بسهولة وعود لتسريع استخدام تكنولوجيا التوجيهية من خلال جعلها في متناول مجتمع بحثي واسع النطاق.
Abstract
من خلال التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ الأربعة، Oct4، Klf4، وSox2 cMyc، يمكن تحويل الخلايا الجسدية الإنسان إلى حالة المحفزة، وتوليد ما يسمى الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) 1-4. المريض محددة iPSCs تفتقر إلى المخاوف الأخلاقية التي تحيط الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، وسوف تجاوز الرفض المناعي ممكن. وهكذا، وقد اجتذبت اهتماما كبيرا لiPSCs دراسات النمذجة المرض، وفحص المركبات الدوائية، والعلاج التجديدي 5.
لقد أظهرنا توليد التحوير خالية iPSCs الإنسان من المرضى الذين يعانون من أمراض الرئة المختلفة باستخدام واحد excisable الجذعية lentiviral متعدد المقارين راديو كاسيت الخليوي (STEMCCA) ترميز العوامل ياماناكا 6. وقد تم توليد هذه الخطوط التوجيهية من الخلايا الليفية الجلد، ونوع من الخلايا الأكثر شيوعا التي تستخدم لإعادة البرمجة. عادة، والحصول على الخلايا الليفية الجلد يتطلب كمة خزعة تليها التوسع في الخليةق في الثقافة لبضع فقرات و. الأهم من ذلك، فقد أفاد عدد من المجموعات إعادة برمجة خلايا الدم المحيطي في iPSCs 7-9. في دراسة واحدة، كان يعمل على إصدار محرض تيت من ناقلات STEMCCA 9، الأمر الذي يتطلب أن تكون خلايا الدم المصابة في وقت واحد مع الفيروسة البطيئة بالموقع جوهري ترميز العكس التتراسيكلين transactivator. وعلى النقيض من الخلايا الليفية، يمكن جمعها عن طريق الخلايا الدموية المحيطية والإجراءات مينيملي، والحد بشكل كبير من الانزعاج والضيق للمريض. ويجوز للبروتوكول بسيطة وفعالة لإعادة برمجة خلايا الدم باستخدام ناقلات التأسيسي excisable واحدة الإسراع في تطبيق التكنولوجيا التوجيهية من خلال جعلها في متناول مجتمع بحثي واسع النطاق. وعلاوة على ذلك، إعادة برمجة الخلايا الدموية المحيطية ويسمح لتوليد iPSCs من الأفراد التي ينبغي تجنبها خزعات الجلد (أي. الشاذة تندب) أو بسبب ظروف المرض موجود مسبقا preventiنانوغرام الحصول على الخزعات لكمة.
هنا علينا أن نبرهن على بروتوكول لتوليد iPSCs الإنسان من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) باستخدام واحد floxed-excisable ناقلات lentiviral معربا عن العوامل جوهري 4. يتم توسيع PBMCs جمعها طازجة أو إذابة لمدة 9 أيام كما هو موضح في المتوسط 10،11 المحتوية على حمض الاسكوربيك، SCF، IGF-1، IL-3 و EPO قبل transduced مع الفيروسة البطيئة STEMCCA. ومطلي الخلايا ثم على MEFs وESC مثل المستعمرات يمكن تصور أسبوعين بعد الإصابة. وأخيرا، يتم توسيع استنساخ مختارة واختبار للتعبير عن علامات تعدد القدرات SSEA-4، ترا-1-60 و ترا-1 81. هذا البروتوكول بسيطة وقوية ومتسقة للغاية، وتوفير منهجية موثوقة لتوليد iPSCs الإنسان من الوصول إليها بسهولة ML 4 من الدم.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا تصف استخدام ناقلات lentiviral STEMCCA لتوليد iPSCs من خلايا وحيدات النوى الإنسان عزله من ملليلتر قليلة من الدم المحيطي جمعها طازجة. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لإعادة برمجة PBMCs المجمدة (التي تم الحصول عليها مباشرة من معطف الشهباء)، والتفاصيل من آثار عملية كبيرة عند اس?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذه الدراسات في جزء من جائزة UO1HL107443 NIH-01 لGJM وجنرال موتورز.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
Riferimenti
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
