Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector
Summary
Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.
Abstract
Door ectopische expressie van vier transcriptiefactoren, Oct4, Klf4, SOX2 en cMyc kunnen menselijke somatische cellen worden omgezet pluripotent toestand genereren zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) 1-4. Patiënt-specifieke iPSCs missen de ethische bezwaren die embryonale stamcellen (SER's) omringen en mogelijk zou afstoting te omzeilen. Zo zijn iPSCs veel aandacht voor de ziekte modelstudies de screening van farmacologische verbindingen en regeneratieve therapieën 5.
We hebben aangetoond dat de generatie van transgene-vrije menselijke iPSCs van patiënten met verschillende longaandoeningen met een enkele accijnsproducten polycistronisch lentivirale Stem Cell Cassette (STEMCCA) dat codeert voor het Yamanaka factoren 6. Deze iPSC lijnen werden gegenereerd uit huidfibroblasten, de meest voorkomende celtype gebruikt voor het herprogrammeren. Normaal verkrijgen fibroblasten heeft een huid biopsie punch gevolgd door expansie van de cels in de cultuur voor een paar passages. Belangrijker is dat een aantal groepen rapporteerden de herprogrammering van humane perifere bloedcellen in iPSCs 7-9. In een studie werd een induceerbare Tet versie van de vector gebruikt STEMCCA 9, welk de bloedcellen gelijktijdig geïnfecteerd met een constitutief actieve lentivirus codeert omgekeerde tetracycline transactivator. In tegenstelling tot fibroblasten, kunnen perifere bloedcellen worden verzameld via minimaal invasieve procedures, wat veel ongemak en pijn van de patiënt. Een eenvoudige en effectieve protocol voor het herprogrammeren van bloedcellen met behulp van een constitutieve enkele accijnsgoederen vector kan versnellen van de toepassing van IPSC-technologie door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap. Bovendien herprogrammering van perifere bloedcellen maakt het genereren van iPSCs van individuen waarin huidbiopsies worden vermeden (dwz. Afwijkende littekens) of door reeds bestaande aandoeningen preventing toegang tot stansbiopsieën.
Hier laten we zien een protocol voor het genereren van menselijke iPSCs van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) met een floxed-accijnsgoederen lentivirale vector constitutief tot expressie de 4 factoren. Vers verzameld of ontdooide PBMC's worden uitgebreid voor 9 dagen, zoals beschreven 10,11 in medium bevattende ascorbinezuur, SCF, IGF-1, IL-3 en EPO alvorens getransduceerd met de STEMCCA lentivirus. Cellen worden vervolgens uitgeplaat op MEFs en ESC-achtige kolonies te visualiseren twee weken na infectie. Tenslotte worden geselecteerde klonen uitgebreid en getest op de expressie van markers pluripotentie de SSEA-4, Tra-1-60 en Tra-1-81. Dit protocol is eenvoudige, robuuste en zeer consistent, een betrouwbare methode voor het genereren van menselijke iPSCs uit gemakkelijk toegankelijke 4 ml bloed.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hierin de toepassing van de STEMCCA lentivirale vector menselijke iPSCs van mononucleaire cellen geïsoleerd uit enkele milliliters van vers verzameld perifeer bloed genereren. Het protocol kan ook gebruikt worden om ingevroren PBMCs (rechtstreeks verkregen uit de buffy coat), een detail van aanzienlijke praktische implicaties herprogrammeren bij gebruik donor cellen verkregen van een verre locatie. Voor de inductie van herprogrammering moet ondergaan geïsoleerde PBMCs een kritische expansiestap dat een …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studies werden deels gefinancierd door NIH UO1HL107443-01 Award uit aan GJM en GM.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
Riferimenti
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
