Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Summary

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Abstract

A través de la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción, Oct4, Klf4, Sox2 y cMyc, las células somáticas humanas se puede convertir en un estado pluripotente, generando así llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPS) ^1-4. Específicos del paciente iPSCs carecen de las preocupaciones éticas que rodean a las células madre embrionarias (CME) y pasaría por alto el rechazo inmunológico posible. Por lo tanto, iPSCs han atraído una considerable atención por los estudios de modelos de enfermedades, la detección de compuestos farmacológicos y terapias regenerativas ^5.

Hemos demostrado la generación de transgén libres de iPSCs humanos de pacientes con enfermedades pulmonares diferentes usando una sola extirpable policistrónico Stem lentiviral casete celular (STEMCCA) que codifica los factores de Yamanaka ^6. Estas líneas IPSC se generaron a partir de fibroblastos de la piel, el tipo de célula más común utilizado para la reprogramación. Normalmente, la obtención de fibroblastos de piel requiere un punzón de biopsia seguida por la expansión de la células en la cultura de algunos pasajes. Es importante destacar que, un número de grupos han informado de la reprogramación de células humanas de sangre periférica en iPSCs ^7-9. En un estudio, una versión inducible Tet del vector STEMCCA se empleó ^9, que requiere las células de la sangre que se infectan simultáneamente con un lentivirus constitutivamente activa que codifica el transactivador inverso tetraciclina. En contraste con los fibroblastos, las células de sangre periférica pueden recogerse a través de procedimientos mínimamente invasivos, reduciendo considerablemente el malestar e incomodidad del paciente. Un protocolo sencillo y eficaz para la reprogramación de células de la sangre utilizando un vector constitutiva sujetos a impuestos especiales solo pueden acelerar la aplicación de la tecnología IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia. Además, la reprogramación de células de sangre periférica permite la generación de iPSCs de individuos en los que las biopsias de piel debe ser evitado (es decir. Aberrante cicatrización) o debido a condiciones de enfermedad pre-existentes Preventing acceso a biopsias.

Aquí se demuestra un protocolo para la generación de iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando una única floxed-extirpable vector lentiviral que expresa constitutivamente los 4 factores. PBMC recién arrancadas o descongelados se expanden durante 9 días descrita ^10,11 en ácido ascórbico que contiene medio, SCF, IGF-1, IL-3 y EPO antes de ser transducidas con el lentivirus STEMCCA. Después las células se sembraron en MEFs y ESC-como colonias se puede visualizar dos semanas después de la infección. Finalmente, los clones seleccionados se expanden y se ensayaron para la expresión de los marcadores de pluripotencia SSEA-4, Tra-1-60 y Tra-1-81. Este protocolo es simple, robusto y muy consistente, proporcionando una metodología fiable para la generación de iPSCs humanos fácilmente accesible desde 4 ml de sangre.

Protocol

1. El aislamiento y la expansión de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) DÍA 0 Dibujar 4 ml de sangre periférica en un tubo BD Vacutainer CPT Preparación célula con citrato de sodio. Invertir el tubo de 8 a 10 veces y centrifugar a 1.800 xg durante 30 min a temperatura ambiente. Idealmente, este paso se debe hacer dentro de 2 horas de recogida. Recoger las células mononucleares (MC) pipeteando la capa leucocitaria (capa de células de barrera entre…

Representative Results

Se demuestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos a partir de PBMCs utilizando un vector lentiviral único. Figura 1A muestra una representación esquemática del protocolo. La sangre se recogió en un tubo BD Vacutainer CPT Preparación célula con citrato de sodio, y después de la centrifugación, las células mononucleares se pueden recoger de la interfaz entre el gel de poliéster y el plasma (buffy coat) (Figura 1B). Las PBMC aisladas se expanden en cu…

Discussion

Nos en la presente memoria se describe el uso del vector lentiviral STEMCCA para generar iPSCs humanos a partir de células mononucleares aisladas de unos pocos mililitros de sangre periférica recién recogida. El protocolo también se puede utilizar para reprogramar PBMCs congeladas (obtenidos directamente a partir de la capa leucocitaria), un detalle de importantes implicaciones prácticas cuando se utilizan células de donantes adquiridos desde una ubicación distante. Antes de la inducción de la reprogramación, P…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate	BD Biosciences	362760
QBSF-60 Stem Cell Medium	Quality Biological	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	Atlanta Biologicals	S10250
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Pen/Strep	Invitrogen	15140
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140
β-mercaptoethanol	MP Biomedicals	190242
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
IGF-1	R&D Systems	291-G1
IL-3	R&D Systems	203-IL
SCF	R&D Systems	255-SC
EPO	R&D Systems	286-EP
Dexamethasone	Sigma	D4902
Polybrene	Sigma	H-9268
bFGF	R&D Systems	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
ES Cell Marker Sample Kit	Millipore	SCR002