Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Summary

Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung entweder<strong> Enzymatische Dissoziation von Zellstoff (DPSC-ED)</strong> Oder<strong> Direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate (DPSC-OG). Dann gefolgt von</strong><em> In vitro</em> Vergleichende Unterscheidung der beiden Arten von hDPSCs zu Odontoblasten.

Abstract

<p class="jove_content"> Entwicklung Weisheitszähne sind leicht zugängliche Quelle von Stammzellen während der Erwachsenenalter, die durch Routine kieferorthopädischen Behandlungen erhalten werden konnte. Menschliche Zellstoff-Stammzellen (hDPSCs) besitzen eine hohe Proliferationspotential mit Multi-lineage Differenzierungspotenzial im Vergleich zu den gewöhnlichen Quelle von adulten Stammzellen^1-8; Daher hDPSCs konnten die gute Kandidaten für autologe Transplantation im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin sein. Neben diesen Vorteilen besitzen die mesenchymalen Stammzellen (MSC) Funktionen wie immunolodulatory Wirkung machen hDPSCs wertvoller, selbst im Fall von Allograft Transplantation^6,9,10. Daher ist der erste Schritt für die Verwendung dieser Quelle von Stammzellen, um die beste Protokoll zur Isolierung von hDPSCs Pulpagewebe auszuwählen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es wichtig, die Wirkung verschiedener Trennung Bedingungen auf unterschiedliche zelluläre Verhaltensweisen wie ihre gemeinsame Oberflächenmarker & auch ihre Differenzierungsfähigkeit zu untersuchen.</p><p class="jove_content"> So, hier sind wir trennen menschlichen Pulpagewebe aus beeinflusst dritten Backenzähne, und dann verwendet werden sowohl bestehende Protokolle auf Literatur, zur Isolierung hDPSCs,^11-13<em> Dh</em> Enzymatischen Spaltung von Pulpagewebe (DPSC-ED) oder Auswuchs aus Gewebeexplantate (DPSC-OG). In dieser Hinsicht haben wir versucht, die Trennung Methoden mit zahnärztlichen Diamantscheibe erleichtern. Dann werden diese Zellen im Hinblick auf Stromazellen-assoziierte Marker (CD73, CD90, CD105 und CD44), hämatopoetische / endothelialen Marker (CD34, CD45 und CD11b), perivaskuläre Marker, wie CD146 sowie STRO-1 gekennzeichnet. Anschließend wurden diese zwei Protokolle basierend auf der Differenzierung Potenz zu Odontoblasten sowohl durch quantitative Polymerasekettenreaktion (QPCR) & Alizarinrot Färbung verglichen. QPCR wurden für die Bewertung der Expression der Mineralisierung Genen (; ALP, extrazellulären Matrix phosphoglycoprotein; MEPE & Dentin Sialophosphoprotein; DSPP alkalische Phosphatase) verwendet.<sup> 14</sup</p>

Introduction

Stammzellen sind Zellen, die klonogenen zwei bemerkenswerte Features, wie Multi-Potenz und Selbst-Erneuerung ¹⁵ bekannt zu besitzen. Unter allen Stammzellen mit verschiedenen Potenzen replikativen haben dentalen Stammzellen als die postnatale Stammzellen Aufmerksamkeit in den letzten Jahren ziehen wegen ihrer Zugänglichkeit, Plastizität und hohe proliferative Fähigkeit im Vergleich zu anderen adulten Stammzellen ^16. Charakteristischerweise ähnlich zu den mesenchymalen Stammzellen sind Zahnpulpa Stammzellen adhärenten Zellen, die mehrfache klonogenen Differenzierungskapazität in Mesenchym und / oder nicht-Mesenchym Abstammungslinien, sowohl in vitro als auch in vivo aufweisen. ^1-8,17,18 DPSCs werden identifiziert durch ihre negative Ausdruck von hämatopoetischen Antigene (zB CD45, CD34, CD14) und positive Expression CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 und STRO-1. ^19,20

Leicht erhalten Potenzial mit minimalen Schmerzen und Morbidität zu menschlichen DPSCs als wertvolleLage Quelle von MSCs zu den gewöhnlichen Quellen, wie Knochenmark mesenchymale Stammzellen ²¹ verglichen. Im Allgemeinen haben sich entweder durch Auswachsen DPSCs Verfahren, dh Migration von Stammzellen aus Zellstoff Gewebeexplantate (DPSC-OG) ^22-24, und / oder durch enzymatischen Verdau (DPSC-ED) ^4,6,25 isoliert worden. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Isolierungsmethode und Kulturbedingungen können verschiedene Populationen oder Linien unter in vitro Durchlässe ^26,27 induzieren. Im Fall der zweiten Zähne (pDPSCs), Huang et al offenbart, dass die enzymatische verdaut pDPSCs höheren Proliferationspotential haben im Vergleich zu den herausgewachsen DPSCs. ²⁶ zudem im Falle von Milchzähnen (dDPSCs), es wurde nachgewiesen, dass STRO-1 & CD34 Marker Ausdruck mehr in dDPSC-ED im Vergleich mit dDPSC-OG. Darüber hinaus erscheint dDPSC-ED höheren Mineralisierungsgeschwindigkeit in definierten osteo / odonto Medium. ²⁷ Daher ist aufgrund der hervorragenden Potenzial DPSCs in regenerative Medizin, werden weitere Studien zum besseren Verständnis der möglichen verschiedenen Populationen, die aus verschiedenen Isolierungsverfahren abgeleitet sind erforderlich.

Hier war es Versuch einfache Art Pulpenextraktion einzuführen, indem in einem Schritt dentalen Diamantscheibe um den Prozess der Pulpenextraktion erleichtern. Darüber hinaus wurde nach der Isolierung von menschlichen Zellstoff-Stammzellen durch Anlegen ED oder OG Methoden wurden allgemeinen Eigenschaften & Differenzierungskapazität zwischen zwei Gruppen ebenfalls untersucht.

Protocol

Ein. Bereiten Sie die Enzymlösung und Proliferation Medium (PM) Make Collagenase Typ I Lösung: Einwaage Collagenase Typ I (12 mg / ml) und lösen sich in 1 ml PBS und Filter unter Verwendung einer Spritze 0,2 um Filter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie bei -20 ° C bis benötigt. Machen Dispase Lösung: abwiegen Dispase (16 mg / ml) auflösen und in 1 ml PBS und Filter mit einer 0,2 um Spritzenfilter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie …

Representative Results

DPSCs, die durch enzymatische Spaltung (DPSC-ED) erhalten wurden, werden hier am Tag 10, 15,18 (Figur 1) dargestellt. Die Kolonien eingeleitet, auf fast 3 bis 5 Tagen nach der Isolierung zu bilden. Entwachsen DPSCs (DPSC-OG) sind in Abbildung 2 an Tag 5, 10, 13 und 18 dargestellt. Fibroblast-ähnliche Zellen aus Pulpagewebe in den Kolben wandern begann parallel Bestellung um fast 5 Tage nach der Aussaat. DPSCs bei Passage 3 mit beiden Methoden sind in Abbildung 3 dargestellt…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung und Charakterisierung von hDPSCs von Zahnpulpa mit zwei Methoden, enzymatische Dissoziation und direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate. Zusätzlich wird in vitro Differenzierung dieser Zellen in Odontoblasten, wurde durch quantitative Alizarinrot S & Assay QPCR beurteilt.

Bestehenden Protokollen zur Isolierung Pulpagewebe aus menschlichen Zahns worden verschiedenen Instrumente wie Zangen (Knochenzange) 9, E…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
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