Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Summary

Метод, описанный выделение и характеристика человека пульпы зуба стволовые клетки (hDPSCs), используя либо<strong> Ферментативного распада целлюлозы (DPSC-ED)</strong> Или<strong> Прямым следствием стволовых клеток из эксплантов тканей пульпы (DPSC-OG). Затем следуют</strong><em> В пробирке</em> Сравнительного дифференциации обоих типов hDPSCs в одонтобластов.

Abstract

<p class="jove_content"> Развитие зубов мудрости легко доступным источником стволовых клеток во взрослом которые могли бы быть получены обычными ортодонтического лечения. Человека целлюлозно-производные стволовые клетки (hDPSCs) обладают высоким потенциалом пролиферации с мульти-линии дифференциации мощности по сравнению с обычным источником взрослых стволовых клеток^1-8, Поэтому hDPSCs могут быть хорошими кандидатами для трансплантации аутологичных в тканевой инженерии и регенеративной медицины. Наряду с этими преимуществами, обладающих мезенхимальных стволовых клеток (МСК) функций, таких как immunolodulatory эффект, сделать hDPSCs более ценной, даже в случае пересадки трансплантата^6,9,10. Таким образом, первым этапом для использования этого источника стволовых клеток, чтобы выбрать лучший протокол для выделения hDPSCs из ткани пульпы. Для того, чтобы достичь этой цели, очень важно исследовать влияние различных условиях изоляции на различных клеточных поведения, такие как их общий поверхностных маркеров и также их дифференциации мощности.</p><p class="jove_content"> Таким образом, здесь мы разделяем человеческие ткани пульпы от воздействия третьих моляров, а затем использовать как существующие протоколы, основанные на литературе, для изоляции hDPSCs,^11-13<em> Т.е.</em> Ферментативного распада ткани пульпы (DPSC-ED), или результатом из ткани эксплантов (DPSC-OG). В связи с этим, мы пытались способствовать изоляции методами с помощью стоматологического алмазного диска. Затем эти клетки характеризуются в терминах стромальных связанные маркеры (CD73, CD90, CD105 и CD44), кроветворной / эндотелиальные маркеры (CD34, CD45 и CD11b), периваскулярные маркер, как CD146, а также STRO-1. После этих двух протоколов были сопоставлены на основе дифференциации потенции в одонтобластов как количественной полимеразной цепной реакции (QPCR) и ализарин Красное окрашивание. QPCR были использованы для оценки выражения минерализации связанных генов (щелочной фосфатазы, ALP, матрица внеклеточной phosphoglycoprotein; Мепе и дентина sialophosphoprotein; DSPP).<sup> 14</sup</p>

Introduction

Стволовые клетки являются клоны клеток, которые обладают двумя замечательными особенностями, известный как мульти-потенцию и самообновления ^15. Среди всех стволовых клеток с разными потенциями репликативной, стоматологические стволовые клетки, как послеродовая стволовых клеток обратили внимание в последние годы из-за их доступности, пластичности и высокой пролиферативной способностью по сравнению с другими взрослыми стволовыми клетками ^16. Характерно, похожие на мезенхимальные стволовые клетки, зубных стволовых клеток пульпы прилипшие клетки клоны, которые имеют несколько потенциал дифференциации в мезенхимы и / или не мезенхимы линий, как в пробирке и в естественных условиях. ^1-8,17,18 DPSCs идентифицируются их негативное выражение гемопоэтических антигены (например, CD45, CD34, CD14), и положительное выражение CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 и STRO-1. ^19,20

Легко получить потенциал с минимальным боли и заболеваемости сделать человека DPSCs как ценныйсостоянии источника МСК по сравнению с обычными источниками, такими как костного мозга мезенхимальные стволовые клетки ^21. В общем, DPSCs были выделены либо результатом метода, т. е. миграции стволовых клеток из ткани пульпы эксплантов (DPSC-OG) ^22-24, и / или путем ферментативного расщепления (DPSC-ED), ^4,6,25. Предыдущие исследования показали, что метод выделения и условия культивирования могут вызывать различные группы населения или линий в пробирке под проходы ^26,27. В случае постоянных зубов (pDPSCs), Хуанг и др. показали, что ферментативные переваривается pDPSCs имеют более высокий потенциал пролиферации по сравнению с переросла DPSCs ^26. Кроме того, в случае молочных зубов (dDPSCs), было показано, что STRO-1 и CD34 Маркеры выразили более dDPSC-ED по сравнению с dDPSC-OG. Кроме того, dDPSC-ED отображаются выше скорость минерализации в определенных костно / odonto среде ^27. Таким образом, благодаря выдающимся потенциалом DPSCs в гegenerative медицины, дополнительные исследования будут необходимы для лучшего понимания возможных различных групп населения, которые получены из различных методов изоляции.

Вот, это была попытка ввести простой способ извлечения целлюлозы, используя один шаг стоматологического алмазного диска для облегчения процесса извлечения целлюлозы. Кроме того, после выделения человека целлюлозно-производные стволовых клеток с применением ЭД или OG методы, общие свойства и способность дифференциации между двумя группами были также исследованы.

Protocol

1. Подготовка раствора фермента и распространения среднего (PM) Сделать коллагеназы типа I Решение: Взвесить коллагеназы типа I (12 мг / мл) и растворяют в 1 мл PBS и фильтр с помощью шприца 0,2 мкм фильтр. Затем поместите его 15 мл трубки и хранить его при температуре от -20 ° C до необ…

Representative Results

DPSCs которые были получены путем ферментативного диссоциации (DPSC-ED) показаны здесь в 10 день, 15,18 (рис. 1). Колонии с инициативой сформировать почти на 3 до 5 дней после изоляции. Переросли DPSCs (DPSC-OG) показаны на рисунке 2 по 5 дней, 10, 13 и 18. Фибробластоподобные клетки начали мигрир?…

Discussion

Этот протокол описывает процесс выделение и характеристика hDPSCs из пульпы зуба с помощью двух методов, ферментативной диссоциации и прямым следствием стволовых клеток из эксплантов тканей пульпы. Кроме того, в пробирке дифференциации этих клеток в одонтобластов, оценивали с помо?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
Flowing Software version 2.3.1