O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs) usando<strong> Dissociação enzimática da celulose (DPSC-ED)</strong> Ou<strong> Conseqüência direta de células-tronco a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-GO). Seguido por</strong><em> In vitro</em> Diferenciação comparativa dos dois tipos de hDPSCs em odontoblastos.
As células-tronco são células que possuem clonogénicos duas características marcantes, conhecidos como multi-potência e auto-renovação 15. Entre todas as células estaminais com potências diferentes replicativas, as células estaminais dentários como as células-tronco pós-natais têm chamado a atenção nos últimos anos por causa da sua acessibilidade, plasticidade e capacidade proliferativa elevada em comparação com as células estaminais adultas outros 16. Caracteristicamente, semelhante para as células estaminais mesenquimais, as células estaminais da polpa dentária são células aderentes clonogénicas que têm a capacidade de diferenciação em múltiplas mesênquima e / ou não-mesênquima linhagens, tanto di vitro como in vivo. 1-8,17,18 DPSCs são identificados pela a sua expressão negativa de antigénios hematopoiéticas (por exemplo, CD45, CD34, CD14), e da expressão de CD90 positivas, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1, 19,20.
Potencial obtida fácil com o mínimo de dor e morbidade fazer DPSCs humanos como um valiosofonte capaz de MSCs em comparação com as fontes comuns, tais como a da medula óssea as células estaminais mesenquimais 21. Em geral, DPSCs ter sido isolada por qualquer método outgrowth, isto é, a migração de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-OG) 22-24, e / ou por digestão enzimática (DPSC-ED) 4,6,25. Estudos anteriores têm mostrado que o método de isolamento e as condições de cultura podem induzir diferentes populações ou linhagens sob passagens di vitro 26,27. No caso dos dentes permanentes (pDPSCs), Huang et al mostraram que enzimáticas pDPSCs digeridos têm um maior potencial de proliferação em comparação com os DPSCs crescido. 26 Por outro lado, no caso dos dentes de leite (dDPSCs), demonstrou-se que STRO-1 e CD34 marcadores expressa mais em dDPSC-ED em comparação com dDPSC-OG. Além disso, dDPSC-ED apresentado maior taxa de mineralização em meio definido osteo / odonto. 27 Portanto, devido ao excelente potencial de DPSCs em regenerative medicina, mais estudos serão necessários para uma melhor compreensão das possíveis várias populações que são derivadas de diferentes métodos de isolamento.
Aqui, ela foi a tentativa de introduzir de maneira fácil a extracção da polpa, utilizando-se um passo de disco de diamante dental para facilitar o processo de extracção da polpa. Além disso, após o isolamento de células-tronco derivadas de celulose, aplicando métodos de ED ou OG, propriedades gerais e capacidade de diferenciação entre os dois grupos também foram investigados.
Este protocolo descreve o processo de isolamento e caracterização de hDPSCs da polpa dentária através de dois métodos, dissociação enzimática e excrescência directa de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose. Além disso, a diferenciação di vitro destas células em odontoblastos, foi avaliada por ensaio quantitativo Vermelho de alizarina S & QPCR.
Os protocolos existentes para o isolamento de tecido de polpa de dentes humanos foram uti…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Dra. Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei para sua discussão crítica e Mohammad Reza Sr. Khadem Sharif por seus apoios técnicos.
Name of the reagent | Company | Catalogue or Lot. number | Comments (optional) |
α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
EQUIPMENT | |||
BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
Fleurcense Microscope | Olympus | ||
Flowing Software version 2.3.1 |