In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren
Summary
Een eenvoudige methode om primaire murine colon tumor organoïde stellen beschreven. Deze methode maakt gebruik van de functie die colon tumorcellen overleven en te groeien in organoids in media die beperkte groei factoren, terwijl de normale colon epitheel niet doen.
Abstract
Verschillende menselijke en murine colonkanker cellijnen zijn vastgesteld, zijn fysiologische integriteit van colon tumoren zoals meerdere cellagen, basale-apicale polariteit vermogen om te differentiëren en anoikis niet colonkanker afgeleide cellijnen gehandhaafd. De huidige studie toont een methode voor het kweken van primaire muis colontumor organoids aangepast van Sato T et al.. 1, die belangrijke fysiologische functies van darmtumoren behoudt. Deze methode bestaat muis colontumor weefselverzameltoestel, aangrenzend normaal colon epitheel dissociatie colontumorcellen digestie in enkele cellen, inbedden colon tumorcellen in Matrigel en selectief kweekmedium gebaseerd op het principe dat tumorcellen handhaven groei beperkende nutriënten vergelijking met normale epitheelcellen.
De primaire tumor organoids als geïsoleerd van genetisch gemodificeerde muizen bieden een zeer nuttig systeem om tumor autonome funct beoordelenion van specifieke genen. Bovendien is de tumor organoids vatbaar zijn voor genetische manipulatie door virus mediteerde genaflevering; daarom signaalwegen betrokken bij de dikke darm ontstaan van tumoren kan ook uitgebreid onderzocht worden door overexpressie of knockdown. Primaire tumor organoids cultuur biedt een fysiologische relevant en haalbaar middel om de mechanismen en therapeutische modaliteiten voor de dikke darm ontstaan van tumoren te bestuderen.
Introduction
De intestinale epitheliale cellen vermenigvuldigen en omdraaien op een buitengewone snelheid, sneller dan alle andere weefsels in het gewervelde lichaam 2,3. De delende cellen, waaronder intestinale stamcellen (ISC) en doorvoer-versterkende cellen differentiëren in beide secretie (beker, Paneth en entero-endocriene cellen) of enterocyten 3. De ISC ligt aan de basis van de crypte. Paneth cellen verplaatsen naar de bodem van de crypten en hebben een lange levensduur, terwijl andere lijnen migreren naar boven aan de villi 3,4. Hier worden de cellen blootgesteld aan de darminhoud inbegrip microbiota worden afgeworpen van de villus uiteinden via een anoikis-geïnduceerde apoptotische mechanisme. Hoewel de colon mist villi en Paneth cellen, het mechanisme voor het handhaven van homeostase soortgelijk 4.
De Wnt signaleringsroute is betrokken bij een cruciale rol in het intestinale proliferatie en ISC onderhoud 4 spelen. Schrapping van the transcriptiefactor TCF4, een stroomafwaartse effector van Wnt signalering leidt tot verlies van intestinale stamcellen en daaropvolgende afbraak van het weefsel 5. Ook transgene expressie van Wnt inhibitor DKK1 vermindert de epitheliale proliferatie en put afscheidende cellijnen 6. Omgekeerd overexpressie van het Wnt-agonist R-spondin-1 induceert krachtige en snelle verspreiding van intestinale crypte cellen 7.
Gezien het belang van Wnt-signalering voor intestinale homeostase, worden Wnt pathway mutaties vaker waargenomen bij darmkanker 8. Darmkanker is de derde belangrijkste oorzaak van overlijden door kanker in de Verenigde Staten 9. Overtollige inname met rood vlees en alcohol, verminderde fysieke activiteit, en erfelijke en somatische mutaties worden beschouwd als risicofactoren van darmkanker 10,11. Het adenomateuze polyposis coli (APC)-gen, een belangrijke factor Wnt signalering wordt gemuteerd in de meeste patients met familiaire, sporadische en colitis-geassocieerde darmkanker 12,13. Mutaties van andere factoren betrokken bij Wnt signaling pathway inbegrip Axin2 en β-catenine zijn eveneens waargenomen bij darmkanker 14,15. Echter, de precieze mechanisme en effectieve therapie voor darmkanker ontbreekt nog. Om het onderzoek naar de moleculaire mechanismen voor darmkanker te vergemakkelijken, hebben menselijke colonkanker cellijnen die verschillende stadia van de progressie van kanker uit een goedaardige om een agressieve celtype vastgesteld 16-18. Muis coloncarcinoom cellijnen met verschillende metastatische eigenschappen zijn ook beschikbaar 19,20. Toch zijn primaire cellen of organoïde culturen voorkeur boven getransformeerde cellijnen, omdat ze nauw nabootsen van de in vivo toestand en het genereren van meer fysiologisch relevante gegevens 21. De meeste dikke darm-kanker afgeleide cellijnen groeien als monolaag bevestigd aan de plaat of als celsuspensies, lacking apicale-basolaterale oriëntatie en krappe kruispunten tussen cellen. Ook normale en tumor intestinale epitheliale cellen in vivo ondergaan een spontane vorm van apoptose genoemd anoikis als de gedifferentieerde cellen bereiken de villus tips en worden afgeworpen 22. Deze functies zijn moeilijk te herhalen in cellijnen maar zijn belangrijk in het ontwikkelingsproces van darmkanker 23. Deze functies worden onderhouden in primaire organoids. Bovendien is de tumor organoïde culturen een efficiënte systeem tumor autonome functies van genen dan in vitro studies evalueren. Genetische manipulatie in vivo van de darm is een tijdrovend proces vooral door het creëren van transgene en / of knockout muizen met darm-specifieke drivers. Echter, de tumor organoids zijn gemakkelijk vatbaar voor virale gemedieerde genetische manipulaties en dus een geweldig hulpmiddel voor het beoordelen precieze moleculaire mechanismen. Primaire darmtumor organoïde culturen have aangetoond dat een haalbaar en krachtige techniek. Primaire intestinale celkweek kan functionele intestinale organoids leggen met crypte-villi structuur in vitro van een enkele volwassen Lgr5 + stamcellen 24. Deze organoids kunnen worden getransplanteerd en geënt in beschadigde darm weefsel voor regeneratie 25. Verdere aanpassing van de kweekomstandigheden waren vergelijkbaar epitheliale organoids gemaakt van muizen en menselijke dikke darm dunne darm en dikke darm haalbaar 1. Voor primaire normale colon epitheel cultuur, basaal kweekmedium evenals groeifactoren zoals EGF, Noggin, R-spondin en Wnt3a zijn essentieel, terwijl basaal kweekmedium en EGF voldoende is voor de teelt van primaire muis colontumor organoids 1. Hier een gedetailleerd protocol te isoleren, cultuur, en het genereren van colontumor organoids beschrijven we.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit protocol beschreven experimentele procedures zal zorgen voor isolatie en kweek van primaire muizen darmtumoren. Het protocol is een bewerking van baanbrekende werk van dr. Clevers groep 1,24,27. We geoptimaliseerd de spijsvertering tijd en collagenase concentratie tot een betere opbrengst van de tumor organoids krijgen. De kritische stappen omvatten tumorcel spijsvertering in enkele cellen, Matrigel resuspensie en selectieve cultuur. Voor tumorcel vertering, om een efficiënte scheiding van da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies aan YMS van de National Institutes of Health (CA148828), De Universiteit van Michigan Maag Peptide Center, en Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research en de Tom Liu Memorial Fondsen van de Universiteit van Michigan Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375 U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8 U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu. Rev. Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R. Wnt/beta-catenin signaling and disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
