Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür
Summary
Primer fare kolon tümörü organoid kurmak için basit bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem kolon tümör hücreleri hayatta kalmak ve epitel normal bir kolon yok ise, sınırlı büyüme faktörleri içeren ortamlarda organoids içine büyümeye bu özelliği kullanır.
Abstract
Çeşitli insan ve fare kolon kanseri hücre hatları kurulmuştur, bu tür birden fazla hücre katmanları, bazal-apikal kutup, ayırt etmek yeteneği ve anoikis gibi kolon tümörlerinin fizyolojik bütünlüğü kolon kanseri edilen hücre hatlarında korunmaz. Mevcut çalışmada, Sato T et al. 1, kolon tümörlerinde önemli fizyolojik özelliklerini korur uyarlanmıştır kültür birincil fare kolon tümör organoids için bir yöntemi gösterir. Bu yöntem, tümör hücrelerinin normal göre besin kısıtlayıcı koşullar üzerinde büyümeyi sürdürmek ilkesine göre fare kolon tümör doku toplanması, komşu normal kolon epitel ayrışma, tek bir hücre içine Kolon tümör hücreleri sindirim, Matrigel içine Kolon tümör hücreleri gömme ve seçici kültür oluşmaktadır epitel hücreleri.
Genetik olarak değiştirilmiş fareler izole ise primer tümör organoids tümör özerk fonksiyon değerlendirmek için çok kullanışlı bir sistem sağlamakBelirli genlerin iyon. Ayrıca, tümör organoids gen teslim meditasyon virüsünün genetik manipülasyon için uygun olan, kolon kanser oluşumunda yer alan bu nedenle sinyal yolları da yoğun aşırı veya demonte incelenmiştir olabilir. Primer tümör organoids kültür kolon tümörogenez için mekanizmalar ve tedavi yöntemleri incelemek için bir fizyolojik ilgili ve uygulanabilir bir yol sağlar.
Introduction
Bağırsak epitel hücreleri çoğalmaya başlar ve omurgalı vücut 2,3 diğer tüm dokular geride bıraktı, olağanüstü bir hızla ters çevirin. Bağırsak kök hücreler (ISC) ve transit yalıtım hücreleri de dahil olmak üzere bölünen hücreleri ya salgı (kadeh, Paneth ve enteroendokrin) hücreleri veya enterositler 3 farklılaşırlar. ISC mahzenin tabanında yer alır. Paneth hücrelerinin kript altına aşağı hareket ve diğer soy villus 3,4 için yukarı göç ise, uzun ömürlü. Burada hücreler Mikrobiyota dahil olmak üzere mide içeriğine maruz kalan ve bir anoikis bağlı apoptotik mekanizma yoluyla villus ipuçları dökülür. Kolon villus ve Paneth hücrelerinin yoksun olsa da, dengesini korumak için mekanizma 4 benzer.
Wnt sinyal yolu bağırsak çoğalması ve ISC bakım 4 çok önemli bir rol oynadığı edilmiştir. Inci silinmesiE transkripsiyon faktörü TCF4, Wnt sinyal bir alt efektör, bağırsak kök hücre ve doku 5 sonraki arıza kaybına yol açar. Benzer şekilde, Wnt inhibitör DKK1 transgenik ifade epitel proliferasyonu azaltır ve salgı hücre soyları 6 tüketir. Tersine, Wnt agonist R-spondin-1 aşırı bağırsak crypt hücrelerinin 7 güçlü ve hızla yayılması neden olur.
Bağırsak dengesini için Wnt sinyal önemi göz önüne alındığında, Wnt yolu mutasyonlar sık kolon kanseri 8 gözlenmektedir. Kolon kanseri Amerika Birleşik Devletleri 9 kanserden ölüm üçüncü önde gelen nedenidir. Kırmızı et ve alkol ile aşırı diyet fiziksel aktivite azalır ve kalıtsal ve somatik mutasyonlar kolon kanseri 10,11 risk faktörleri olarak kabul edilir. Adenomatöz polipozis koli (Süm) gen, önemli bir Wnt sinyal faktör, pa bir çoğunda mutasyona uğramışailesel, sporadik ve kolit ile ilişkili kolon kanseri 12,13 ile hastaları. Axin2 ve β-katenin dahil olmak üzere Wnt sinyal yolu ile ilgili diğer faktörlerin mutasyonlar da kolon kanseri 14,15 gözlenmektedir. Ancak, kolon kanseri için kesin mekanizması ve etkin tedavi hala eksiktir. Kolon kanseri için moleküler mekanizmaların soruşturma kolaylaştırmak için, agresif hücre tipi için iyi huylu kanser ilerleme farklı aşamalarında temsil eden insan kolon kanseri hücre hatları 16-18 kurulmuştur. Farklı metastatik özelliklere sahip Fare kolon karsinoma hücre çizgileri 19,20 mevcuttur. Yakından in vivo durumda taklit eder ve daha fazla fizyolojik olarak ilgili verileri 21 oluşturmak için Bununla birlikte, birincil hücreler veya organoid kültürleri dönüştürülmüş hücre çizgileri tercih edilir. En kolon kanseri hücre çizgileri elde edilen sonik, plakasına bağlı olarak tek tabakalı ya da hücre süspansiyonları olarak büyürapikal-bazolateral yönelim ve hücreler arasındaki sıkı bağlantıları g. Farklılaşmış hücrelerin villus ipuçları ulaşmak ve 22 döken olarak Ayrıca, in vivo normal ve tümör bağırsak epitel hücrelerinde apoptoz olarak adlandırılan anoikis kendiliğinden bir formu tabi. Bu özellikler, hücre hatlarında özetlemek zordur, fakat kolon kanseri 23 gelişim sürecinde önemlidir. Bu özellikler, primer organoids tutulur. Buna ek olarak, tümör organoid in vivo çalışmalar, kültürler ile karşılaştırıldığında genlerin tümör otonom işlevleri değerlendirmek için etkili bir sistem sağlar. Bağırsak in vivo genetik manipülasyon özellikle bağırsak-özel sürücüler kullanılarak transgenik ve / veya nakavt fareler yaratarak bir zaman alan bir süreçtir. Ancak, tümör organoids kolayca viral aracılı genetik manipülasyon için uygun ve bu nedenle hassas moleküler mekanizmaları değerlendirmek için harika bir araçtır. Primer intestinal tümör organoid kültür have uygun bir ve güçlü bir teknik olduğu gösterilmiştir. Birincil bağırsak hücre kültürü tek bir yetişkin Lgr5 + kök hücre 24 in vitro crypt-villus yapısı ile fonksiyonel bağırsak organoids kurabilir. Bu organoids nakledilen ve rejenerasyon 25 için hasarlı kolon doku içine engrafted olabilir. Kültür koşulları daha da adaptasyon fare kolon ve insan ince bağırsak ve 1 uygun kolondan benzer epitel organoids yapmıştı. Bazal kültür ortamı ve EGF primer fare kolon tümör organoids 1 büyüme için yeterli iken, birinci, normal kolon epitel kültür, bazal kültür ortamı için hem de EGF, Noggin, R-spondin ve Wnt3a büyüme faktörleri dahil olmak üzere, çok önemlidir. Burada ayrıntılı bir protokol, izole kültür ve kolon tümör organoids oluşturmak için açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde tarif edilen deneysel prosedürler farelerdeki primer fare kolon tümörlerinde, izolasyonu ve kültürü için izin verir. Protokol Dr Clevers grup 1,24,27 tarafından yapılan ufuklar iş uyarlanmıştır. Biz tümör organoids daha iyi verim almak için sindirim süresi ve kollajenaz konsantrasyonu optimize edilmiş. Kritik adımlar tümör tek hücre içine hücre sindirim, Matrigel tabanda ve seçici kültürünü içerir. Tümör hücre sindirim için, sırayla kolon tümörlerinde etkin a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (CA148828), Michigan Gastrointestinal Peptide Merkezi Üniversitesi ve Michigan Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi Jeffrey A. Colby Kolon Kanseri Araştırma ve Tom Liu Memorial fonlarından YMS için hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375 U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8 U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu. Rev. Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R. Wnt/beta-catenin signaling and disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
