In vitro Organoid Culture of Primary Mouse colontumorer
Summary
En enkel metode for å etablere primær murine colon tumor organoid er beskrevet. Denne metoden benytter den funksjonen som kolon kreftceller overleve og vokse inn organoids i media som inneholder begrensede vekstfaktorer, mens normal kolon epitel ikke.
Abstract
Flere menneskelige og murine tykktarm kreft cellelinjer er etablert, er fysiologisk integritet colontumorer eksempel flere cellelag, basal-apikal polaritet, evne til å skille, og anoikis ikke vedlikeholdes i tykktarm kreft avledet cellelinjer. Denne studien viser en metode for dyrking primære mus kolon svulst organoids tilpasset fra Sato T et al. En, som beholder viktige fysiologiske funksjoner av tykktarmskreft. Denne metoden består av mus kolon svulstvev samling, ved normal kolon epitel dissosiasjon, colon tumor celler fordøyelsen i enkeltceller, embedding kolon kreftceller inn matrigel, og selektiv kultur basert på prinsippet om at kreftceller opprettholde veksten på å begrense næringsforhold i forhold til normal epitelceller.
Den primære svulst organoids hvis isolert fra genmodifiserte mus gir en svært nyttig system for å vurdere svulst autonome funksjonsion av spesifikke gener. Videre svulst organoids er mottagelig for genetisk manipulasjon av virus mediterte genet levering, derfor signalveier involvert i tykktarmen tumorigenesis kan også bli grundig undersøkt av overexpression eller knockdown. Primærtumor organoids kultur gir en fysiologisk relevante og gjennomførbare måter å studere mekanismer og terapeutiske modaliteter for kolon tumorigenesis.
Introduction
Intestinal epitelceller sprer og slå over på en ekstraordinær rate, overgår alle andre vev i virveldyr kroppen 2,3. Skillelinjene celler, inkludert intestinal stamceller (ISC) og transitt-forsterke celler differensieres til enten sekretoriske (pokal, Paneth og enteroendocrine) celler eller enterocytter tre. ISC ligger ved foten av krypten. Paneth celler flytte ned til bunnen av krypter og lever lenge, mens andre linjene vandrer oppover til villi 3,4. Her cellene er utsatt for gut-innhold, inkludert bakterieflora og er utgytt fra villus tips gjennom en anoikis-indusert apoptose mekanisme. Selv om kolon mangler villi og Paneth celler, er mekanismen for å opprettholde homeostase lignende fire.
Wnt signalveien har vært innblandet i å spille en avgjørende rolle i intestinal spredning og ISC vedlikehold fire. Sletting av the transkripsjonsfaktor TCF4, en nedstrøms effektor av Wnt signalering, fører til tap av intestinal stamceller og påfølgende nedbryting av vevet fem. Tilsvarende reduserer transgene uttrykk for Wnt inhibitor DKK1 epiteliale spredning og utarmer sekretoriske celle linjene seks. Omvendt, induserer overuttrykte Wnt agonist R-spondin-en potent og rask spredning av intestinal krypten celler 7.
Gitt betydningen av Wnt signalering for intestinal homeostase, er Wnt veien mutasjoner ofte observert i tykktarmskreft åtte. Tykktarmskreft er den tredje største årsaken til død av kreft i USA ni. Overflødig inntak med rødt kjøtt og alkohol, redusert fysisk aktivitet, og arvet og somatiske mutasjoner anses å være risikofaktorer for tykktarmskreft 10,11. Den adenomatøs polypose coli (APC) genet, en viktig Wnt signalering faktor, er mutert i et flertall av patients med familiær, sporadisk, og kolitt-assosiert tykktarmskreft 12,13. Mutasjoner av andre faktorer involvert i Wnt signalveien inkludert Axin2 og β-catenin er også observert i tykktarmskreft 14,15. Imidlertid er den nøyaktige mekanismen og effektiv behandling for tykktarmskreft fortsatt mangler. For å lette etterforskningen av de molekylære mekanismer for tykktarmskreft, har menneskets tykktarm kreft cellelinjer som representerer ulike stadier av kreft progresjon fra en godartet til en aggressiv celletype er etablert 16-18. Mus kolon cellelinjer med ulike metastatisk egenskaper er også tilgjengelig 19,20. Likevel er primære celler eller organoid kulturer foretrukket over transformerte cellelinjer fordi de tett etterligne in vivo staten og generere mer fysiologisk relevante data 21. De fleste tykktarm-kreft avledet cellelinjer vokse som monolag festet til platen eller som en cellesuspensjon, ha hørg av apikal-basolateral orientering og trange veikryss mellom celler. Også, normal og svulst intestinal epitelceller in vivo gjennomgå en spontan form av apoptose betegnet anoikis som de differensierte cellene nå villus tips og er utgytt 22. Disse funksjonene er vanskelig å rekapitulere i cellelinjer, men er viktig i utviklingsprosessen av tykktarmskreft 23. Disse funksjonene er opprettholdt i grunnskolen organoids. I tillegg er de tumor organoid kulturer gi et effektivt system for å vurdere tumor autonome funksjoner av gener i forhold til in vivo studier. Genetisk manipulering in vivo av tarmen er en tidkrevende prosess hovedsakelig gjennom å skape transgen og / eller knockout mus ved hjelp av tarmen-spesifikke drivere. Men svulsten organoids er lett mottagelig for virus-medierte genetiske manipulasjoner og dermed et flott verktøy for å vurdere presise molekylære mekanismer. Primære intestinal tumor organoid kulturer have vist seg å være en mulig og kraftfull teknikk. Primær intestinal cellekultur kan etablere funksjonelle tarm organoids med krypten-villi struktur in vitro fra en enslig voksen Lgr5 + stamcelle 24. Disse organoids kan transplanteres og innpodet i skadet tykktarmen vev for regenerering 25. Ytterligere tilpasning av kultur forholdene hadde gjort lignende epiteliale organoids fra mus tykktarm og menneskelig tynntarm og tykktarm gjennomførbart en. For primære normal kolon epitel kultur, basal kultur medium samt vekstfaktorer inkludert EGF, Noggin, R-spondin og Wnt3a er avgjørende, mens basal kultur medium og EGF er tilstrekkelig for dyrking primære mus kolon svulst organoids en. Her beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere, kultur, og generere kolon svulst organoids.
Protocol
Representative Results
Discussion
De eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen vil gi rom for isolasjon og kultur av primære murine tykktarmskreft. Protokollen er tilpasset fra banebrytende arbeid utført av Dr. Clevers gruppe 1,24,27. Vi optimalisert fordøyelse tid og collagenase konsentrasjon for å få et bedre utbytte av tumor organoids. De kritiske trinnene omfatter svulst celle fordøyelsen i enkeltceller, Matrigel resuspensjon, og selektiv kultur. For tumorcelle fordøyelsen, for å oppnå effektiv dissosiasjon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet med tilskudd til YMS fra National Institutes of Health (CA148828), The University of Michigan Gastrointestinal Peptide Center og Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research og Tom Liu Memorial Funds ved University of Michigan Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375 U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8 U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu. Rev. Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R. Wnt/beta-catenin signaling and disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
