Summary
בשנים האחרונות להיווצרות של תאי הנבט המשתמשים בשיטות תרבות במבחנה הודגמה תוך שימוש בסוגים שונים של תאי גזע סומטיים. מאמר זה יציג חזותי התמיינות של תאי גזע שמקורם יילוד עכבר לתאים דמויי ביצית מוקדמות.
Abstract
לומד היווצרות תאי נבט ובידול באופן מסורתי היה קשה מאוד עקב מספרים סלולריים נמוכים ומיקומם העמוק בתוך עוברים מתפתחים. הזמינות של "סגור" במערכת מבוססת מבחנה יכולה להוכיח לא יסולא בפז להבנה של gametogenesis שלנו. היווצרות של ביצית דמויות תאים (OLCs) מתאי גזע סומטיים, שבודדו מעור עכבר יילוד, הודגמה ויכולה להיות דמיינו בפרוטוקול בסרטון זה. את OLCs כתוצאה להביע סמנים שונים בקנה אחד עם ביציות כגון Oct4, ושה, Bmp15, וScp3. עם זאת, הם נשארים מסוגלים לעבור התבגרות או הפריה בשל אי השלמת המיוזה. פרוטוקול זה יספק מערכת שהיא שימושית לחקר היווצרות השלב מוקדם והתמיינות של תאי הנבט לתוך תאי מין בוגרים יותר. במהלך ההתמיינות מוקדמת במספר התאים המבטאים Oct4 (כמו תאי חיידק פוטנציאליים) מגיע ל ~ 5%, עם זאת בשלב זה Formation של OLCs נותר בלתי יעיל יחסית. הפרוטוקול הוא יחסית ישר קדימה אם כי יש לנקוט זהירות מיוחדת על מנת להבטיח את אוכלוסיית התאים בריאה ומתחיל במעבר מוקדם.
Introduction
במהלך העובר בשלב מוקדם, gametogenesis מתרחש דרך סדרה של שלבים, כולל תא חיידק קדמוני (PGC) היווצרות, הגירה, ולבסוף קולוניזציה של רכסי האשכים. במהלך תקופה זו עובר PGCs ריבוי והתמיינות לתאי מין יותר ויותר בוגרים יותר 1. העובדה שPGCs נודד מהבסיס של allantois לעובר במעי האחורי ולבסוף לאורך הקיר הגבי סופו של דבר ליישב את רכסי האשכים הופכת אותם קשה מאוד ללמוד 2. למרות התקדמות בתחום, מחקרים המנסים להבין את היווצרות והתמיינות PGC כבר הקשו על ידי המספר המוגבל שלהם, מיקום ואופי נדידת 3,4.
בשנים האחרונות הוכחו בתאי גזע עובריים יש פוטנציאל ליצירת תאי הנבט במבחנה 5,6. כמו כן, כמה תאי גזע הסומטיים יש גם הוכחו כבעלי הפוטנציאל ליצירת תאי הנבט Follבשל בגידול חוץ 7-11. לאחרונה תאי גזע שבודדו מעור עכבר יילוד היו מובחן במבחנה לתאים דמויי חיידק וביציות בשלבים מוקדמים 12. במהלך בידול תת הקבוצה של תאי הגזע המבטאים Oct4 גדלה ומתחמים המזכירים מבני קומולוס-ביצית נוצרו. הביצית דמויות התאים (OLCs) ניתן לאסוף מהתרבויות ובהשוואה לביציות טבעיות. שימוש בשיטה זו התרבות OLCs מדידת 40-45 מיקרומטר מתקבלים כי סמנים דומים מפורשים לביציות כגון Gdf9b, ושה, וDAZL. עד כה את OLCs התוצאה יישאר מסוגל להתבגר או להיות מופרה 12.
למרות OLCs יישאר מסוגל לתפקד פרוטוקול המשמש ליצירת OLCs אלה ייתכן שעדיין יש שירות כassay ללמוד היווצרות וההתפתחות של תאי הנבט בשלבים מוקדמים יותר בתוך מערכת סגורה במבחנה. הפרסום המקורי שדן בהיווצרות של OLCs מכךתאי גזע matic מנוצלים עור עוברי חזירי כמקור תאי גזע 8. הרחבת על מחקר שהתאים דמויי PGC נוצרו מוקדם במהלך התמיינות מושרה הוצגו להיות מבשרי לסמנים כאלה PGC מפורש OLCs וכOct4, ושה, סטלה, C-KIT, וDAZL 13. נתונים אלו תומך בפוטנציאל של ניצול מערכת זו כדי ללמוד היווצרות חיידק והתמיינות של תאים במבחנה. הפרוטוקול מנוצל כדי ליצור OLCs מעור עכבר יילוד יהיה הפגין במאמר זה וידאו. פרוטוקול זה מציע במודל חוץ גופית ללמוד פיתוח תא חיידק שעשוי לספק אמצעי על מנת להבהיר גורמים חשובים להתפשטות וההתמיינות שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מדיה הכנה
- הכן תקשורת 2-3 שעות מראש של שימוש ומקום עם כובע משוחרר בתא שבו תרבות חממת הניסוי יהיה מתרחש. מדיה בשימוש בפרוטוקול הנוכחי:
- הכן נובע מדיום סלולרי בהיקף של DMEM/F12 בתוספת 1 X B27, 40 ng / ml bFGF, ו20 ng / ml EGF.
- להכין מדיום התמיינות תאים נבט בהיקף של M199 בתוספת FSH 0.05 IU, 0.03 IU LH, 3 מ"ג / מיליליטר BSA, 5, פירובט הנתרן 0.23 מ"מ μl / מ"ל, 1 מ"ג / מיליליטר Fetuin, וng 1 / מיליליטר EGF. מדיום בסיס המורכב של כל התוספים אבל השמטת FSH, LH יכול להיות מוכן וEGF ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
2. גזע הכנת תרבית תאים
- בודד תאי גזע מגורי עכבר יילוד כפי שתואר לעיל 12. לנצל את תאי גזע בחלוף 2-4 בהתמיינות תאי נבט מבחנה. היעילות שלהיווצרות של נקודתי טיסה קשורה באופן ישיר לאיכות של תאי הגזע מתחילים. עדיף להתחיל את הבידול בהקדם האוכלוסייה נראית נקי ובריא שהוא בדרך כלל בסביבות מעבר 2. culturing עוד 2 מעבר העבר בתאי גזע משפיע לרעה על יעילות היווצרות של נקודתי הטיסה (תוצאות לא פורסמו).
- 48 שעות לפני ייזום בידול תת תרבות תאי הגזע. הסר את כל המצרפים המושעים כדוריים הסלולריים והתקשורת בילתה ממנת התרבות, באמצעות פיפטה סרולוגיות ומניחה בשפופרת 15 מ"ל. חשוב לאסוף רק המצרפים המושעים כדוריים של תאים ולא התאים המחוברים לתחתית הצלחת, כי הם באופן ספונטני מבדל.
- גלולה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות., לבטל את supernatant, resuspend ב 500 μl של תקשורת תאי גזע טרי חימם עד 37 ° C. בעדינות פיפטה המצרפים לניתק באופן חלקי את התאים. לא באגרסיביות אל פיפטה תאים כמו זה יפחית כדאיות תא. לשטוף את התאים באופן חלקי ניתק לתוך 9.5 מ"ל של מדיום תאי גזע מראש חימם טרי על צלחת נמוכה מצורף 10 ס"מ תא תרבות.
- להחזיר את התאים ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתרבית תאים באינקובטור במשך 48 שעות לפני תחילתו של הבידול.
3. בידול של נקודתי טיסה
- בעזרת פיפטה סרולוגיות להסיר את תאי גזע ממנת התרבות והמקום בצינור 15 מ"ל, להשאיר מאחור את כל תאים מחוברים אליו. גלולה התאים ב XG 500 ו resuspend ב 500 PBS סטרילי μl. פיפטה הנמרצת את התאים באמצעות רחב נשאו 1,000 קצה μl לתוך גושים לא גדולים יותר מ 10-20 תאים. מעת לעת להסיר כמות קטנה של תאים, בעת הניתוק, ולבדוק תחת מיקרוסקופ אור לבן כדי לאשר תאים מצטברים בגושים של 10-20 תאים בודדים. על ניתוק יגרום לכדאיויות תא מופחתת.
- הוסף 9.5 מ"ל PBS לתאים ניתק ולהוסיף 15 μl של השעיה תא זה לhemocytometer לספירת תאים. גלולה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות.
- Re-להשעות את התאים בריכוז של 6 1.32X10 תאים / מ"ל במדיום התמיינות.
- צלחת התאים על ידי הוספת 500 μl לכל גם לתחתית שטוחה 24 מנה השעיה היטב.
- מניחים את צלחת 24 גם לתוך תא תרבות חממה ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 48 שעות. הסר 250 בינוניות μl מכל טוב ומקום בצינור שכותרתו 1.5 מ"ל בהתאמה. הוסף 250 בינוני בידול טרי μl היטב כל אחד. צנטריפוגה את המדיום בילה בXG 500 במשך 5 דקות. וזורקים supernatant. Resuspend כל תאי pelleted ב50 בינוני בידול טרי μl ולחזור לתרבות המקבילה גם על צלחת הבידול.
- בכל 48 שעות לשנות את המחצית בינונית עד 12 יום של בידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בתחילה את התאים לצרף לתחתית צלחת התרבות ונפרשו. ב42-72 שעות להתמיינות תאי Oct4 חיוביים קטנים מושעים להיוצר ולהתרבות (איור 1 א). זמן קצר לאחר ההדמיה של תאים אלה הרוב ייעלם והתאים המצורפים יהוו אגרגטים מושבה צפופים בתחתית התרבות. בעקבות כמה ימי אגרגטים אלה להתנתק ממשטח התרבות. בחלק מאגרגטים אלה ניתן לראות תאים גדולים (איור 1b ו1 ג'). על ההדמיה ראשונית התאים יהיו ~ 35 מיקרומטר בקוטר. עם תרבות המשך את OLCs יגדל להגיע ~ 45 מיקרומטר בקוטר. אלה הם OLCs ויכולים להיות שנאספו עם תאי תמיכה או trypsinized להשיג OLCs ללא תאים אחרים מצורפים (1D איור).
על מנת לאשר כי OLCs להביע תמלילים דומים כביציות טבעיות ניתן לאסוף את OLCs ונבדק עלביטוי של סמנים כגון Zpc, Scp3, CMOS, Oct4, Bmp15, ושה. בעוד שה Oct4 ובאים לידי ביטוי בתאי גזע התמיינות כמה סמנים כגון Bmp15 וZpc הם ביצית ספציפיות. BMP15 הוא חבר של משפחת TGF-β, והוא מעורב בביצית והתפתחות זקיקים. מבנה קרום pellucida הביצית הספציפי Zona מורכב מכמה חלבונים, כולל ZP3. הביטוי של סמנים ספציפי ביצית אלה ניתן להשתמש כדי לאשר את קיומו של OLCs בבידול. יתר על כן, הביטוי של סמני meiotic ספציפיים כגון Scp3 ו-CMOS יכול לזהות תאים שעלולים להיות meiotic בתוך מערכת התרבות. בדוגמא שספקה 10 ו -10 ביציות OLCs נאספו וסינתזת cDNA ישירה בוצעה (איור 2). הדגימות נובעות לאחר מכן נבדקו באמצעות PCR חצי כמותית. השוואה בין הביטוי של סמנים אלה לביציות עכבר טבעיות שאנו רואיםהבדלים ברמות של תמלילים (איור 2). סמנים רבים שהביעו ביציות יבואו לידי ביטוי על ידי OLCs אם הבידול היה מוצלח.
איור 1. מורפולוגיות שכיחות במהלך התמיינות מושרה של תאי גזע שמקורם בעור. א) בתאי התמיינות בשלבים מוקדמים חיוביים לOct4 (ירוק) יכול להיות מזוהה בתרבות. Nucleuses הם מוכתמים דלפק עם Hoechst (כחול). ב) עם התקדמות בידול מסוימים אגרגטים תא יהיה לראות עם Oct4 (ירוק) תאים חיוביים מוקפים Oct4 תאים שליליים. מכתים גרעיני עם Hoechst גם מתואר (כחול). ג) תמונת אור לבנה של מבנה דמוי זקיק לאחר ניתוק ממשטח התרבות. ד) במהלך הבדלניתן לראות גם מוקפים בתאים או ביחידות בתוך התרבות Oct4 תאים חיוביים גדולים erentiation (ירוק) כמו ביצית. סולם ברים: א = 20 מיקרומטר, B = 100 מיקרומטר, C = 40 מיקרומטר, ד = 10 מיקרומטר.
איור 2. רמת תעתיק בOLCs, בהשוואה לביציות, ביצית של סמנים נפוצים. תוצאות בזמן אמת PCR נציג המראות את רמת התעתיק של סמני ביצית נפוצות בOLCs. השוואה זו היא כתוצאה מ10 דמויי תאי ביצית שלעומת 10 ביציות עכבר זה עתה נולדו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עד כה OLCs הפונקציונלי לא פותחו באמצעות לחלוטין בassay חוץ גופית. לאחרונה מחקר על ידי הייאשי et al. היה מסוגל לייצר צאצאים מדמויים PGC תאים שנוצרו במבחנה והועברו in vivo להמשך פיתוח 14. החל עם תאי גזע עובריים או תאי pluripotent מושרה הם הצליחו ליצור תאים PGC כמו אשר, כאשר התאוששו בעקבות in vivo ההשתלה היו מסוגלים להיות התבגר, מופרה, ומשמש ליצירת צאצאים 14. זה מוכיח כי תאי גזע ממקורות שונים שיש לו את הפוטנציאל, בתנאים הנכונים, כדי ליצור ביציות תפקודיות.
היבטים מסוימים של מערכת התרבות הנן קריטיים לתפקודו. הזן של עכברים מנוצלים כדי לבודד את תאי הגזע הוא מאוד חשוב. פרוטוקול זה פותח ושימוש עם עכברי B6 מהמעבדה ג'קסון (צילומים # 008,214). עכברים אלה נושאים transgene Oct4-EGFP מאפשר מולualization של תאים לבטא Oct4 באמצעות חלבון EGFP. כאשר הפרוטוקול היה ניסיון בשימוש בתאי גזע מעכברי CD1 היעילות הייתה נמוכה בהרבה וההיווצרות של נקודתי הטיסה הייתה פחות אמינה. נכון לעכשיו את היעילות של היווצרות של נקודתי טיסה נשארת נמוכה גם בעת שימוש B6 עכברים. תאי הגזע צריכים להיות מנוצלים בחלוף 2-4 לפני התמיינות תאי נבט ייזום כיעילות של היווצרות תאי נבט היא נמוכה בהרבה, כאשר שימוש בתאי מעבר מאוחרים יותר. המקור של חומרים כימיים שונים גם הוכיח את עצמו חשוב.
הניתוח של תעתיקי mRNA שונים בOLCs עשוי להיות שימושי באופטימיזציה של מערכת התרבות. באמצעות PCR חצי כמותית מאפשר השוואה של מספר רמות ביטוי בין סמני OLCs וביציות (איור 2). התוצאות מראות כי את OLCs להביע פחות Zpc מביציות, מה שעשוי להסביר את האופי השברירי וקרום דק של pellucida Zona OLCs. הביטוי של סמן מיוזה
הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטת שליטה במבחנה ללמוד היווצרות תאי נבט ובידול. נכון לעכשיו התאים דמויי PGC שנוצרו אינם יכולים ליצור OLCs הפונקציונלי כאשר נשמר במבחנה. כאשר מצטברים בתאים הסומטיים בשחלות יילוד ולהשתיל את תאי in vivo כמו PGC מסוגלים ליצור זקיקים משניים בשלבים מוקדמים. עם זאת, כאשר הם התאוששו OLCs הם עדיין מצליח להיות אמין והתבגרו מופרה 12. השירות בassay זה מגיע מלימוד תאי הנבט מראש meiotic מקורם בתאי גזע הסומטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מע"צ נתמכת על ידי מכון קנדי לבריאות מחקר מלגה (CIHR) ומענק CIHR לג'רלד קידר באוניברסיטה מערבית. המחבר גם רוצה להכיר Julang לי באוניברסיטת Guelph לעזרה בפיתוח של הפרוטוקול המובא כאן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
