Summary
På senare år bildandet av könsceller användning av in vitro odlingsmetoder har visats med användning av flera olika typer av somatiska stamceller. Denna artikel kommer att visuellt presentera differentiering av nyfödda härledda musstamceller till tidiga äggcellen-liknande celler.
Abstract
Studera formation könsceller och differentiering har traditionellt varit mycket svårt på grund av låga cellantal och deras placering djupt i utvecklingsländerna embryon. Tillgången till ett "stängt" in vitro-baserat system kan visa sig ovärderligt för vår förståelse av gametogenes. Bildandet av äggceller-liknande celler (OLCs) från somatiska stamceller isolerade från nyfödd mus hud, har påvisats och kan visualiseras i denna video protokoll. De resulterande OLCs uttrycker olika markörer som överensstämmer med oocyter som Oct4, Vasa, Bmp15 och Scp3. Däremot förblir de oförmögna att genomgå mognad eller befruktning på grund av ett misslyckande att slutföra meios. Detta protokoll kommer att tillhandahålla ett system som är användbart för att studera det tidiga stadiet bildning och differentiering av könsceller mot mognare gameter. Under tidig differentiering av antalet celler som uttrycker Oct4 (potentiella grodden-liknande celler) når ~ 5%, dock för närvarande fFörnyelsen av OLCs förblir relativt ineffektiv. Protokollet är relativt enkelt men särskild försiktighet bör vidtas för att säkerställa startcellen befolkningen är frisk och på ett tidigt passage.
Introduction
Under tidig fosterutveckling sker gametogenes genom en serie steg, inklusive ursprungliga könsceller (PGC) bildande, migration, och slutligen kolonisering av gonadala åsar. Under denna tid PGCs genomgår proliferation och differentiering till alltmer mer mogna könsceller 1. Det faktum att PGCs migrera från basen av allantois i embryot hindgut och slutligen längs ryggens väggen slutligen kolonisera de gonadala åsar gör dem ytterst svåra att studera 2. Trots framsteg inom området, har studier som försöker förstå PGC bildning och differentiering har hindrats av deras begränsade antal, placering, och flyttande art 3,4.
Under senare år har embryonala stamceller har visat sig ha potential att bilda könsceller in vitro 5,6. På samma sätt har flera somatiska stamceller också visat sig ha potential att bilda könsceller follgrund odling in vitro 7-11. Nyligen stamceller isolerade från nyfödd mus hud differentierades in vitro i grodden-liknande celler och tidiga oocyter steget 12. Under differentiering den delmängd av de stamceller som uttrycker Oct4 ökat och strukturer som liknar cumulus-äggcell komplex bildades. Oocyten-liknande celler (OLCs) kan plockas från kulturerna och jämfört med naturliga oocyter. Med hjälp av denna OLCs kultur metod som mäter 40-45 nm erhålles som beskriver liknande markörer till oocyter såsom Gdf9b, VASA, och DAZL. Hittills de resulterande OLCs förblir oförmögen att mogna eller gödslas 12.
Även de OLCs förblir oförmögen att fungera det protokoll som används för att bilda dessa OLCs fortfarande kan ha användbarhet som en analys för att undersöka bildandet och utvecklingen av tidigare celler arrangerar könsceller inom ett stängt in vitro-system. Den ursprungliga publikationen diskutera bildandet av OLCs från såtiska stamceller utnyttjas fostrets svinhud som en stamcell källa 8. Expanderande på den studien PGC-liknande celler bildas tidigt under inducerad differentiering visade sig vara förstadier till OLCs och uttrycka sådana PGC markörer som Oct4, VASA, STELLA, C-KIT, och DAZL 13. Dessa data stödjer potentialen att utnyttja detta system för att studera bildandet könsceller och differentiering in vitro. Protokollet används för att bilda OLCs från nyfödd mus hud kommer att demonstreras i denna video artikeln. Detta protokoll ger en in vitro-modell för att studera utvecklingen könsceller som kan vara ett sätt att belysa faktorer som viktiga för deras proliferation och differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Media Preparation
- Förbered media 2-3 tim före användning och plats med ett lossat lock i cellodling inkubator där experimentet kommer att äga rum. Media som används i detta protokoll:
- Förbered stamceller medium bestående av DMEM/F12 kompletterat med 1 x B27, 40 ng / ml bFGF och 20 ng / ml EGF.
- Förbered groddar mediet celldifferentiering bestående av M199 supplementerat med 0,05 lU FSH, 0,03 lU LH, 3 mg / ml BSA, 5 | il / ml ITS, 0,23 mM natriumpyruvat, 1 mg / ml Fetuin, och 1 ng / ml EGF. En bas medium bestående av alla tillsatser men utan FSH, kan LH och EGF beredas och lagras vid 4 ° C i upp till en vecka.
2. Stem Förberedelse Cell Culture
- Isolera stamceller från nyfödda mus ungar som tidigare beskrivits 12. Utnyttja stamceller vid passage 2-4 för in vitro könscell differentiering. Effektiviteten iOLC bildning är direkt relaterad till kvaliteten hos utgångsmaterialen stamceller. Det är bäst att starta differentieringen så snart befolkningen visas ren och frisk, som är i allmänhet vid omkring passage 2. Ytterligare odla stamceller tidigare passage 2 inverkar negativt på OLC formation effektivitet (opublicerade resultat).
- 48 timmar före initiering differentiering subkultur stamcellerna. Ta bort alla suspenderade sfäriska cellaggregat och använt media från kulturen skålen, med hjälp av en serologisk pipett och placera i en 15 ml tub. Det är viktigt att endast samla de suspenderade sfäriska aggregat av celler och inte de celler som sitter på undersidan av skålen som spontant differentiera.
- Pellets cellerna vid 500 xg under 5 min., Kassera supernatanten och suspendera i 500 l av färska stamcellsmedier uppvärmd till 37 ° C. Försiktigt pipettera aggregaten att delvis dissociera cellerna. Inte aggressivt Pipettera cellens eftersom detta kommer att minska cellernas viabilitet. Tvätta de partiellt dissocierade celler i 9,5 ml färsk förvärmd stamcellmedium på en låg infästning 10 cm cellodlingsskål.
- Återgå cellerna till en 37 ° C, 5% CO 2 cellkultur inkubator under 48 timmar före initieringen av differentiering.
Tre. OLC Differentiering
- Med hjälp av en serologisk pipett avlägsna stamceller från kulturen skålen och placera det i en 15 ml tub, lämna bakom alla anslutna celler. Pellets cellerna vid 500 xg och återsuspendera i 500 l steril PBS. Kraftig pipett cellerna med hjälp av ett stort hål 1,000 il tips till klumpar inte större än 10-20 celler. Periodvis bort en liten mängd celler, under dissociation, och kolla under ett vitt ljus mikroskop för att bekräfta aggregerade cellerna är i klumpar av 10-20 enskilda celler. Över dissociation kommer att resultera i reducerad cellviabilitet.
- Lägg 9,5 ml PBS till de dissocierade celler och tillsätt 15 pl av denna cellsuspension till en hemocytometer för cellräkning. Pellets cellerna vid 500 xg under 5 minuter.
- Återsuspendera cellerna i en koncentration av 1.32X10 6 celler / ml i differentieringsmedium.
- Plate cellerna genom tillsats av 500 ul per brunn i en flatbottnad 24 väl suspensionen skålen.
- Placera 24 väl skålen in i en cellkultur inkubator vid 37 ° C i 5% CO2 under 48 timmar. Ta 250 pl medium från varje brunn och placera i en motsvarande märkt 1,5 ml rör. Tillsätt 250 l färska differentiering medium till varje brunn. Centrifugera det använda mediet vid 500 xg under 5 min. och kassera supernatanten. Resuspendera eventuella pelleterade cellerna i 50 | il färskt differentieringsmedium och återgå till motsvarande odlingsbrunn på differentiering plattan.
- Varje 48 tim ändra halva mediet upp till dag 12 av differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ursprungligen cellerna fäster till kulturen skålen botten och sprida ut. Vid 42-72 tim i differentiering små suspenderade Oct4 positiva celler bildas och föröka sig (Figur 1A). Strax efter visualisering av dessa celler majoriteten kommer att försvinna och de bifogade cellerna bildar täta kolonier aggregat på kulturen botten. Efter ett par dagar dessa aggregat kommer att lossna från odlingsytan. I vissa av dessa aggregat en stor cell kan observeras (Figur 1b och 1c). Vid första visualisering av cellerna kommer att vara ~ 35 mikrometer i diameter. Med fortsatt odla OLCs kommer att växa för att nå ~ 45 | im i diameter. Dessa är de OLCs och kan samlas in med stöd celler eller trypsinbehandlas att erhålla OLCs utan andra celler fästa (figur 1d).
För att bekräfta att de OLCs uttrycker liknande transkript som naturliga oocyter de OLCs kan samlas in och testas föruttryck av sådana markörer som ZPC, Scp3, CMOS, Oct4, Bmp15 och Vasa. Medan Oct4 och Vasa uttrycks i odifferentierade stamceller flera markörer såsom Bmp15 och ZPC är äggcellen specifik. BMP15 är en medlem av TGF-β familjen och är involverad i äggcellen och follikulär utveckling. Äggcellen specifika zona pellucida membran struktur består av flera proteiner inklusive ZP3. Uttrycket av dessa oocyte specifika markörer kan användas för att bekräfta närvaron av OLCs i differentieringar. Vidare kan uttrycket av meiotiska specifika markörer såsom Scp3 och CMOS upptäcka möjliga meiotiska celler i odlingssystemet. I det exempel som nämns 10 OLCs och 10 oocyter uppsamlades och direkt cDNA-syntes utförs (fig. 2). De erhållna proverna testades sedan med hjälp av semikvantitativ PCR. Jämföra uttrycket av dessa markörer till naturliga musoocyter vi serskillnader i nivåerna av transkript (Figur 2). Många markörer uttrycks av oocyter kommer att uttryckas genom OLCs om differentiering var framgångsrik.
Figur 1. Vanliga morfologier under inducerad differentiering av hudens stamceller. a) Under tidiga celler stadium differentiering positiva för Oct4 (grön) kan detekteras i kulturen. Kärnor är räknare färgas med Hoechst (blå). B) Eftersom differentieringen fortskrider vissa cellaggregaten kommer att ses med Oct4 (grön) positiva celler omgivna av Oct4 negativa celler. Nukleär färgning med Hoechst visas också (blå). C) Ett vitt ljus bild av en follikel-liknande struktur efter avskildhet från odlingsytan. D) Under differentiation stora Oct4 positiva (grön) äggcellen-liknande celler kan ses antingen omges av celler eller styckevis inom kulturen. Skalstrecken: a = 20 pm, b = 100 um, c = 40 pm, d = 10 | im.
Figur 2. Avskrift nivå OLCs, jämfört med oocyter, av vanliga äggcell markörer. Representativa realtids PCR resultat som visar avskriften nivå av gemensamma äggcell markörer i OLCs. Denna jämförelse leder från 10 äggcell-liknande celler som jämförs med 10 nyfödda musoocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hittills funktionella OLCs inte har utvecklats med hjälp av en helt in vitro. Nyligen en studie av Hayashi et al. Kunde producera avkomma från PGC-liknande celler som bildas in vitro och överfördes in vivo för vidare utveckling 14. Börjar med ES-celler eller inducerade pluripotenta de kunde bilda PGC liknande celler som, när de återvinns efter in vivo transplantation kunde vara mognat, gödslas, och används för att generera avkomma 14. Detta visar att stamceller från olika källor har potential, under rätt förutsättningar, för att bilda funktionella oocyter.
Vissa aspekter av kultur-systemet är avgörande för det fungerar. Stammen av möss som används för att isolera stamceller är mycket viktigt. Detta protokoll har utvecklats och används med B6-möss från Jackson Lab (Stock # 008.214). Dessa möss bär en Oct4-EGFP transgen så visualization av celler som uttrycker Oct4 via EGFP-proteinet. När protokollet försökte med hjälp av stamceller från CD1 effektiviteten var mycket lägre och OLC formationen var mindre tillförlitlig. För närvarande effektiviteten av OLC formation förblir låg även när du använder B6-möss. De stamceller celler som används bör vara på passagen 2-4 innan behandling könsceller differentiering som effektiviteten i könsceller bildas är mycket lägre vid användning av senare passage celler. Källan för olika reagens också har visat sig vara viktiga.
Analysen av olika mRNA-transkript i OLCs kan vara användbar för att optimera odlingssystemet. Använda semikvantitativ PCR möjliggör jämförelse av flera markörer expressionsnivåer mellan OLCs och oocyter (Figur 2). Resultaten visar att de OLCs uttrycka mindre ZPC än oocyter, vilket kan förklara den sköra naturen och tunnare zona pellucida membran av OLCs. Uttrycket av meios markör
Protokollet som beskrivs här ger en styrd in vitro-metod för att studera bildandet könsceller och differentiering. För närvarande PGC-liknande genererade celler är oförmögna att bilda funktionella OLCs när upprätthållas in vitro. När aggregeras med nyfödda äggstockarna somatiska celler och transplanteras in vivo på PGC-liknande celler kan bilda tidigt stadium sekundära folliklar. Men när OLCs återvinns de fortfarande inte kan tillförlitligt mognat och befruktas 12. Nyttan i denna analys kommer från att studera pre-meiotic könsceller härledda från somatiska stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
PWD stöds av en kanadensiska Institutes of Health Research Fellowship (CIHR) och en CIHR bidrag till Gerald M. Kidder vid Western University. Författaren vill också erkänna Julang Li vid universitetet i Guelph för hjälp med utvecklingen av protokollet presenteras här.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
