Summary
हाल के वर्षों में इन विट्रो संस्कृति तरीकों में उपयोग कर जर्म कोशिकाओं के गठन दैहिक स्टेम कोशिकाओं के कई अलग अलग प्रकार का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया है. यह लेख नेत्रहीन जल्दी डिम्बाणुजनकोशिका कोशिकाओं की तरह करने के लिए नवजात माउस ली गई स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को पेश करेंगे.
Abstract
रोगाणु सेल गठन और भेदभाव का अध्ययन कर पारंपरिक रूप से कम सेल नंबर और विकासशील भ्रूण के भीतर गहरे अपने स्थान के कारण बहुत मुश्किल हो गया है. इन विट्रो आधारित प्रणाली में एक "बंद" की उपलब्धता gametogenesis के बारे में हमारी समझ के लिए अमूल्य साबित हो सकता है. नवजात माउस त्वचा से अलग दैहिक स्टेम सेल से oocyte की तरह कोशिकाओं (OLCs) के गठन को प्रदर्शित किया गया है और इस वीडियो प्रोटोकॉल में देखे जा सकते हैं. परिणामस्वरूप OLCs ऐसे Oct4, वासा, Bmp15, और Scp3 रूप oocytes के साथ लगातार विभिन्न मार्करों व्यक्त करते हैं. हालांकि, वे परिपक्वता या अर्धसूत्रीविभाजन पूरा करने के लिए एक विफलता के कारण निषेचन से गुजरना करने में असमर्थ रहते हैं. इस प्रोटोकॉल अधिक परिपक्व युग्मकों में जर्म कोशिकाओं के प्रारंभिक चरण के गठन और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है कि एक प्रणाली प्रदान करेगा. जल्दी भेदभाव के दौरान Oct4 व्यक्त कोशिकाओं की संख्या (संभावित रोगाणु कोशिकाओं की तरह) लेकिन वर्तमान में, च ~ 5% तक पहुँचOLCs की ormation के अपेक्षाकृत अक्षम रहता है. विशेष देखभाल शुरू सेल आबादी स्वस्थ और एक जल्दी पारित होने में है सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए हालांकि प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सीधे आगे है.
Introduction
जल्दी embryogenesis दौरान gametogenesis मौलिक रोगाणु सेल (PGC) गठन, प्रवास, और जननांगों लकीरें के अंत में बसाना सहित चरणों की एक श्रृंखला के माध्यम से होता है. इस समय के दौरान PGCs तेजी से और अधिक परिपक्व युग्मक 1 में प्रसार और भेदभाव से गुजरना. PGCs भ्रूण पश्चांत्र में अपरापोषिका के आधार से और अंत में अंत में जननांगों लकीरें बस्तियां पृष्ठीय दीवार के साथ विस्थापित तथ्य यह है कि 2 अध्ययन करने के लिए उन्हें बेहद मुश्किल बना देता है. क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, PGC गठन और भेदभाव को समझने का प्रयास पढ़ाई अपने सीमित संख्या, स्थान, और प्रवासी प्रकृति 3,4 द्वारा बाधित किया गया है.
हाल के वर्षों में भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं इन विट्रो 5,6 में रोगाणु कोशिकाओं के रूप में करने की क्षमता है करने के लिए दिखाया गया है. इसी तरह, कई दैहिक स्टेम कोशिकाओं को भी रोगाणु कोशिकाओं foll फार्म की क्षमता है करने के लिए दिखाया गया हैइन विट्रो संवर्धन 7-11 में कारण. हाल ही में नवजात माउस त्वचा से अलग स्टेम सेल रोगाणु कोशिकाओं की तरह है और प्रारंभिक चरण oocytes 12 में इन विट्रो में भेदभाव कर रहे थे. भेदभाव के दौरान Oct4 व्यक्त स्टेम कोशिकाओं के सबसेट वृद्धि हुई है और संरचनाओं जैसी मेघपुंज-oocyte के परिसरों का गठन किया गया. डिम्बाणुजनकोशिका की तरह कोशिकाओं (OLCs) संस्कृतियों से उठाया और प्राकृतिक oocytes की तुलना में किया जा सकता है. 40-45 माइक्रोन मापने इस संस्कृति विधि OLCs का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं कि इस तरह के Gdf9b, वासा, और DAZL रूप oocytes को व्यक्त करने के लिए इसी तरह की मार्करों. तिथि करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप OLCs 12 परिपक्व करने के लिए या निषेचित करने में असमर्थ रहते हैं.
OLCs इन OLCs फार्म का उपयोग किया प्रोटोकॉल अभी भी भीतर पहले चरण रोगाणु कोशिकाओं के निर्माण और विकास का अध्ययन करने के लिए एक परख के रूप में उपयोगिता हो सकती है कार्य करने में असमर्थ रहते हैं एक इन विट्रो प्रणाली में बंद कर दिया. इतने से OLCs के गठन पर चर्चा के मूल प्रकाशनराजनयिक स्टेम कोशिकाओं को एक स्टेम सेल के स्रोत के रूप में 8 भ्रूण सुअर त्वचा का उपयोग किया. प्रेरित भेदभाव के दौरान जल्दी गठन PGC कोशिकाओं की तरह, Oct4 रूप OLCs और एक्सप्रेस ऐसे PGC मार्कर को वासा, स्टेला, सी किट, और DAZL 13 व्यापारियों होना दिखाया गया है कि अध्ययन पर विस्तार. इस डेटा में इन विट्रो में जर्म सेल गठन और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने की क्षमता का समर्थन करता है. नवजात माउस त्वचा से OLCs उपयोग के लिए फार्म प्रोटोकॉल इस वीडियो लेख में प्रदर्शन किया जाएगा. इस प्रोटोकॉल उनके प्रसार और भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण कारक है स्पष्ट करने के लिए एक साधन उपलब्ध करा सकता है कि रोगाणु सेल विकास का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक प्रदान करता है.
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Protocol
1. मीडिया तैयारी
- प्रयोग की जगह ले जाएगा जहां सेल कल्चर इनक्यूबेटर में एक ढीला टोपी के साथ प्रयोग और जगह के अग्रिम में मीडिया 2-3 घंटे तैयार. वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है मीडिया:
- 1 एक्स B27, 40 एनजी / एमएल bFGF, और 20 एनजी / एमएल EGF साथ पूरक DMEM/F12 से मिलकर सेल के माध्यम स्टेम तैयार.
- 0.05 आइयू FSH, 0.03 आइयू एलएच, 3 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 5 μl / एमएल इसके, 0.23 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1 मिलीग्राम / एमएल Fetuin, और 1 एनजी / एमएल EGF साथ पूरक M199 से मिलकर रोगाणु सेल भेदभाव मध्यम तैयार. सभी योजक से मिलकर लेकिन एफएसएच छोड़ते हुए एक आधार मध्यम, एलएच और EGF डिग्री सेल्सियस के ऊपर एक सप्ताह तक के लिए तैयार है और 4 में संग्रहीत किया जा सकता है.
2. सेल संस्कृति तैयार स्टेम
- पहले 12 के रूप में वर्णित नवजात माउस पिल्ले से स्टेम सेल अलग. इन विट्रो रोगाणु सेल भेदभाव के लिए पारित होने के 2-4 में स्टेम कोशिकाओं का उपयोग. की दक्षताOLC गठन सीधे शुरू स्टेम कोशिकाओं की गुणवत्ता से संबंधित है. यह जैसे ही आबादी के पारित होने के लगभग 2 में आम तौर पर है, जो स्वच्छ और स्वस्थ दिखाई देता है के रूप में भेदभाव शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है. इसके अलावा संवर्धन स्टेम सेल अतीत मार्ग 2 नकारात्मक OLC गठन दक्षता (अप्रकाशित परिणाम) को प्रभावित करता है.
- पूर्व उप संस्कृति स्टेम सेल भेदभाव की शुरुआत करने के लिए 48 घंटे. सभी निलंबित गोलाकार सेल समुच्चय और खर्च मीडिया संस्कृति पकवान से, एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह निकालें. यह केवल निलंबित गोलाकार कोशिकाओं के समुच्चय और नहीं अनायास फर्क कर रहे हैं कि डिश के नीचे से जुड़ी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- 5 मिनट के लिए 500 XG पर गोली कोशिकाओं., सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और ताजा स्टेम सेल मीडिया के 500 μl में resuspend 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम धीरे आंशिक रूप से कोशिकाओं को अलग कर देना समुच्चय विंदुक. आक्रामक सेल पिपेट मतइस रूप में सेल व्यवहार्यता कम हो जाएगा. एक कम लगाव 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान पर ताजा पूर्व गर्म स्टेम सेल के माध्यम से 9.5 मिलीलीटर में आंशिक रूप से अलग कोशिकाओं को धो लें.
- भेदभाव की दीक्षा से पहले 48 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें.
3. OLC भेदभाव
- एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक का प्रयोग एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में संस्कृति पकवान और जगह से स्टेम कोशिकाओं को हटाने, किसी भी संलग्न कोशिकाओं को पीछे छोड़ दें. 500 μl बाँझ पीबीएस में 500 XG और resuspend पर गोली कोशिकाओं. जोरदार पिपेट एक व्यापक उपयोग कोशिकाओं 10-20 कोशिकाओं से बड़ा नहीं clumps में 1,000 μl टिप बोर. समय समय पर हदबंदी के दौरान, कोशिकाओं की एक छोटी राशि निकालने के लिए, और एकत्रित कोशिकाओं 10-20 व्यक्ति की कोशिकाओं के clumps में हैं पुष्टि करने के लिए एक सफेद रोशनी खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें. हदबंदी के ऊपर कम सेल व्यवहार्यता का परिणाम देगा.
- अलग कोशिकाओं को 9.5 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और 1 जोड़सेल गिनती के लिए एक hemocytometer को इस सेल निलंबन के 5 μl. 5 मिनट के लिए 500 XG पर गोली कोशिकाओं.
- 1.32X10 6 कोशिकाओं / भेदभाव मध्यम में एमएल के एक एकाग्रता में कोशिकाओं को फिर से निलंबित.
- एक फ्लैट नीचे में प्रति अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से निलंबन पकवान 500 μl जोड़कर प्लेट कोशिकाओं.
- 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 में 37 पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से पकवान डिग्री सेल्सियस रखें. एक तदनुसार लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक अच्छी तरह से और जगह से 250 μl मध्यम निकालें. प्रत्येक अच्छी तरह से 250 μl ताजा भेदभाव मध्यम जोड़ें. 5 मिनट के लिए 500 XG पर खर्च मध्यम अपकेंद्रित्र. और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 50 μl ताजा भेदभाव मध्यम में किसी भी pelleted कोशिकाओं Resuspend और भेदभाव थाली पर अच्छी तरह से इसी संस्कृति पर वापस जाएँ.
- हर 48 घंटे भेदभाव के दिन 12 से आधा मध्यम बदल जाते हैं.
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Representative Results
प्रारंभ में कोशिकाओं संस्कृति पकवान नीचे करने के लिए देते हैं और बाहर फैल गया. भेदभाव में 42-72 घंटे में छोटे निलंबित Oct4 सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में और (चित्रा 1 ए) पैदा करना. फौरन इन कोशिकाओं के दृश्य के बाद बहुमत से गायब हो जाएगा और संलग्न कोशिकाओं संस्कृति तल पर घने कॉलोनी समुच्चय के रूप में होगा. कुछ दिनों के बाद इन समुच्चय संस्कृति सतह से अलग होगा. इन समुच्चय में से कुछ में एक बड़ी सेल (चित्रा 1b और -1 सी) मनाया जा सकता है. प्रारंभिक दृश्य पर कोशिकाओं व्यास में ~ 35 माइक्रोन होना होगा. निरंतर संस्कृति के साथ OLCs व्यास में ~ 45 माइक्रोन तक पहुँचने के लिए विकसित होगा. ये OLCs हैं और समर्थन कोशिकाओं के साथ एकत्र या (चित्रा 1 माह) संलग्न अन्य कोशिकाओं के बिना OLCs प्राप्त करने के लिए trypsinized किया जा सकता है.
OLCs प्राकृतिक oocytes के रूप में इसी तरह के टेप व्यक्त कि की पुष्टि करने के क्रम में OLCs के लिए एकत्र की है और परीक्षण किया जा सकता हैZPC, Scp3, CMOS, Oct4, Bmp15, और वासा के रूप में इस तरह के मार्करों की अभिव्यक्ति. Oct4 और वासा undifferentiated स्टेम कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं जबकि ऐसे Bmp15 और ZPC के रूप में कई मार्करों डिम्बाणुजनकोशिका विशिष्ट हैं. BMP15 TGF-β परिवार का एक सदस्य है और oocyte और कूपिक विकास में शामिल है. डिम्बाणुजनकोशिका विशिष्ट zona pellucida झिल्ली संरचना ZP3 सहित कई प्रोटीन से बना है. इन डिम्बाणुजनकोशिका विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति differentiations में OLCs की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस तरह के Scp3 और CMOS के रूप meiotic विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति संस्कृति प्रणाली के भीतर संभावित meiotic कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं. उदाहरण में 10 OLCs प्रदान की है और 10 oocytes (चित्रा 2) एकत्र की है और प्रत्यक्ष सीडीएनए संश्लेषण प्रदर्शन किया गया. परिणामस्वरूप नमूने तो अर्द्ध मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग कर परीक्षण किया गया. हम देख प्राकृतिक माउस oocytes के लिए इन मार्करों की अभिव्यक्ति की तुलनाटेप के स्तर में मतभेद (चित्रा 2). भेदभाव सफल रहा था अगर oocytes के द्वारा व्यक्त की कई मार्करों OLCs द्वारा व्यक्त किया जाएगा.
चित्रा 1. त्वचा प्राप्त स्टेम कोशिकाओं से प्रेरित भेदभाव के दौरान आम morphologies है. Oct4 (हरा) के लिए सकारात्मक प्रारंभिक चरण भेदभाव कोशिकाओं के दौरान एक) संस्कृति में पता लगाया जा सकता है. Nucleuses काउंटर Hoechst (नीला) के साथ दाग रहे हैं. भेदभाव की प्रगति ख) कुछ सेल समुच्चय Oct4 (हरा) Oct4 नकारात्मक कोशिकाओं से घिरे सकारात्मक कोशिकाओं के साथ देखा जाएगा. Hoechst के साथ परमाणु धुंधला भी (नीला). ग) संस्कृति सतह. घ से अलगाव के बाद एक कूप की तरह संरचना का एक सफेद रोशनी छवि) रचनाकार के दौरान दिखाया गया हैerentiation बड़े Oct4 सकारात्मक (हरा) डिम्बाणुजनकोशिका कोशिकाओं की तरह या तो संस्कृति के भीतर कोशिकाओं या अकेले से घिरा हुआ देखा जा सकता है. स्केल सलाखों: एक = 20 माइक्रोन, ख = 100 माइक्रोन, ग = 40 माइक्रोन, घ = 10 माइक्रोन.
चित्रा 2. आम oocyte के मार्कर के oocytes, की तुलना में OLCs में ट्रांसक्रिप्ट स्तर,. OLCs में आम oocyte के मार्कर की प्रतिलिपि स्तर दिखा प्रतिनिधि वास्तविक समय पीसीआर परिणाम. इस तुलना 10 डिम्बाणुजनकोशिका कोशिकाओं की तरह 10 नवजात माउस oocytes की तुलना में किया जा रहा से उत्पन्न है.
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Discussion
कार्यात्मक OLCs तिथि करने के लिए इन विट्रो परख में एक पूरी तरह से विकसित का उपयोग नहीं किया गया है. हाल हयाशी एट अल द्वारा एक अध्ययन. इन विट्रो में गठन किया है और आगे के विकास के लिए 14 vivo में हस्तांतरित कोशिकाओं-PGC तरह से संतान उत्पन्न करने में सक्षम था. वे इन विवो प्रत्यारोपण में निम्नलिखित बरामद किया है, जो जब कोशिकाओं की तरह PGC बनाने में सक्षम थे ES कोशिकाओं या प्रेरित pluripotent कोशिकाओं के साथ शुरू, परिपक्व निषेचित, और संतानों 14 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने में सक्षम थे. यह विभिन्न स्रोतों से स्टेम सेल कि कार्यात्मक oocytes के लिए फार्म, सही परिस्थितियों में, संभावित है दर्शाता है.
संस्कृति प्रणाली के कुछ पहलुओं को यह कार्य करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग किया चूहों का तनाव बहुत महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल जैक्सन लैब (स्टॉक # 008214) से बी -6 चूहों के साथ विकसित और इस्तेमाल किया गया था. इन चूहों की अनुमति एक Oct4-EGFP transgene ले विज़EGFP प्रोटीन के माध्यम से Oct4 व्यक्त कोशिकाओं की ualization. प्रोटोकॉल CD1 चूहों से स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करने का प्रयास किया था जब दक्षता बहुत कम थी और OLC गठन कम विश्वसनीय था. वर्तमान में OLC गठन की दक्षता बी -6 चूहों का उपयोग करते समय भी कम रहता है. बाद में पारित होने की कोशिकाओं का उपयोग करते समय रोगाणु सेल के गठन की दक्षता में काफी कम है के रूप में उपयोग स्टेम कोशिकाओं से पहले की शुरुआत रोगाणु सेल भेदभाव को पारित होने के 2-4 पर होना चाहिए. विभिन्न अभिकर्मकों के स्रोत भी महत्वपूर्ण साबित हो गया है.
OLCs में विभिन्न mRNA टेप का विश्लेषण संस्कृति प्रणाली के अनुकूलन में उपयोगी साबित हो सकता है. अर्द्ध मात्रात्मक पीसीआर का प्रयोग OLCs और oocytes (चित्रा 2) के बीच कई मार्करों अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना के लिए अनुमति देता है. परिणाम OLCs नाजुक प्रकृति और OLCs की पतली zona pellucida झिल्ली जो समझा जा सकता oocytes, कम से कम ZPC व्यक्त करता है. अर्धसूत्रीविभाजन मार्कर की अभिव्यक्ति
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल रोगाणु सेल गठन और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो में नियंत्रित तरीका प्रदान करता है. वर्तमान में उत्पन्न PGC कोशिकाओं की तरह इन विट्रो में बनाए रखा जब कार्यात्मक OLCs फार्म करने में असमर्थ हैं. नवजात डिम्बग्रंथि दैहिक कोशिकाओं के साथ एकत्रित और इन विवो में प्रत्यारोपित PGC कोशिकाओं की तरह प्रारंभिक चरण माध्यमिक रोम बनाने में सक्षम हैं. हालांकि OLCs बरामद कर रहे हैं जब वे अभी भी मज़बूती से परिपक्व और 12 निषेचित होने में असमर्थ हैं. इस परख में उपयोगिता दैहिक स्टेम सेल से प्राप्त पूर्व meiotic जर्म कोशिकाओं का अध्ययन करने से आता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
पीडब्ल्यूडी पश्चिमी विश्वविद्यालय में गेराल्ड एम. किडर को स्वास्थ्य अनुसंधान फैलोशिप (CIHR) और एक CIHR अनुदान की कनाडा के संस्थानों द्वारा समर्थित है. लेखक भी यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के विकास के साथ मदद के लिए Guelph विश्वविद्यालय में Julang ली स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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