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Immunologia e infezioni

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Published: January 17, 2014
doi:
10.3791/50490
, , ,
1Department of Pathology and Molecule Medicine,McMaster University

Summary

연쇄상 구균 폐렴을 이용한 뮤린 비소하린의 식민지화및 신봉또는 모집된 세포의 후속 추출이 설명된다. 이 기술은 나아레를 통해 유체의 비소하린과 수집을 플러시하는 것을 포함하며, 시투에서mRNA 발현의 차동 세포 정량화 및 분석을 포함한 다양한 판독에 적응할 수 있다.

Abstract

연쇄상 구균 폐렴에 의한 비인두 식민지는 폐 또는 혈류량1에침입하는 전제 조건이다. 이 유기체는 비소하린의 점막 표면을 식민지화 할 수 있으며, 여기서 호스트 방어를 극복하고 호스트의 다른 조직에 침입할 수 있습니다. 일반적으로 낮은 호흡기에 감염의 설립은 폐렴귀착됩니다. 대안적으로, 박테리아는 높은 사망률2와연관되는 박테혈증을 일으키는 혈류로 전파할 수 있고, 또는 그렇지 않으면 폐렴구균 수막염의 발달로 직접 이끌어 낼 수 있다. 비인두 식민지의 운동 및 면역 반응을 이해하는 것은 S. 폐렴 감염 모델의 중요한 측면입니다.

비강 내 식민지화의 마우스 모델은 인간모델3로부터 적응하고 비소하린4-7의 숙주 병원체 반응 연구에서 여러 연구군에 의해 사용되어 왔다. 모델의 첫 번째 부분에서, 우리는 인간 성인의 운송 이벤트와 유사한 자기 제한 세균 성 식민지를 확립하기 위해 S. 폐렴의 임상 분리를 사용합니다. 본명 상세절차는 세균성 접종의 준비를 포함하고, 그 다음에는 행정의 비강 내 경로를 통해 접종의 전달을 통해 식민지화 사건의 수립을 포함한다. 상주 대식세포는 정상 상태 동안 비소하린의 주요 세포 유형이다. 전형적으로, 감염되지 않은 마우스에 존재하는 몇몇 림프구가8,그러나 점막 식민지는 면역 반응 및 호스트 면역 세포의 후속 모집귀착될 낮은- 고급 염증 (세균성 종 및 긴장의 독성에 따라 다름)으로 이끌어 낼 것입니다. 이러한 세포는 나레를 통해 기관 내용물의 용암에 의해 격리될 수 있으며, 감염의 운동학을 더 잘 이해하기 위해 식민지 박테리아의 밀도와 상관관계가 있다.

Protocol

시작하기 전에: 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 생물 적 위험 수준 2 (BSL2) 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 수행됩니다. 실험 개시 전에 기관 지침에 따라 전염성 세균 병원균의 사용에 대한 적절한 생체 위험 승인을 획득했습니다. 또한 사전에 준비된 절차를 수행하는 데 필요한 모든 재료와 시약이 있는지 확인하십시오. 이 실험에 사용된 마우스는 잭슨 연구소, 찰스 강 또는 타코닉에?…

Representative Results

그림 1은 프로토콜의 주요 단계를 요약한 개요 회로도를 나타냅니다. 도 2-3은 본 원에 기재된 프로토콜에 내재된 미생물 방법론의 시각화를 제공한다. 도 4는 내비강폐를 수행하기 위해 마우스의 적절한 위치를 나타내고, 도 5는 S. 폐렴 균주 P1547로 식민지화된 마우스의 무게의 전형적 변화를 묘사한다. 도 6-7은 이러한 두 기술?…

Discussion

이 연구에서는 연쇄상 구균 폐렴의 임상 분리 균주와 박테리아에 대한 응답으로 nasopharynx에 모집 된 면역 세포의 후속 격리 및 특성화를 사용하여 마우스의 비강 내 식민지화를위한 자세한 방법을 제시했습니다. 우리는 어떻게 세균성 접종이 영양이 풍부한 매체에서 배양되고 처음에 비소하린으로 제한되는 마우스에 있는 식민지 사건을 설치하는 데 사용될 수 있는지 보여주었습니다. 그?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 연쇄상 구균 폐렴의임상 긴장의 그의 선물에 대한 펜실베니아 대학의 박사 제프리 와이저에게 감사드립니다. 이 연구는 건강 연구를 위한 캐나다 학회에 의해 투자되었습니다. 이력서는 M. G. DeGroote 펠로우십과 캐나다 흉부 학회의 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 온타리오 폐 협회와 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에 의해 투자되었다. 보우디시 실험실에서 일하는 것은 감염증 연구를 위한 마이클 G. DeGroote 센터 및 맥매스터 면역학 연구 센터에 의해 부분적으로 지원됩니다.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26G3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001
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Riferimenti

  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  3. McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
  4. Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
  5. van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
  6. Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
  7. Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
  8. McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
  9. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
  10. Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
  11. Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  12. Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
  13. Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  14. Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
  15. Wu, H. -. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  16. Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
  17. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
  18. Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
  19. Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
  20. Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
  21. Bryant, W. P., J, , et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I.. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  22. Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
  23. Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
  24. Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
  25. Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  26. Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
  27. Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
  28. Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
  29. Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
  30. Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
  31. Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
  32. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  33. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  34. Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
  35. Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
  36. Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
  37. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  38. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
  39. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).

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Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).
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