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Immunologia e infezioni

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014
doi:
10.3791/50490
, , ,
1Department of Pathology and Molecule Medicine,McMaster University

Summary

La colonización del nasopharynx murine con pneumoniae del estreptococo y la extracción subsecuente de células adherentes o reclutadas se describe. Esta técnica consiste en enjuagar la nasofaringe y la recolección del líquido a través de las narinas y es adaptable para varias lecturas, incluyendo la cuantificación celular diferencial y el análisis de la expresión de ARNm in situ.

Abstract

La colonización nasofaríngea por Streptococcus pneumoniae es un requisito previo para la invasión a los pulmones o al torrente sanguíneo1. Este organismo es capaz de colonizar la superficie mucosa de la nasofaringe, donde puede residir, multiplicarse y eventualmente superar las defensas del huésped para invadir a otros tejidos del huésped. El establecimiento de una infección en las vías respiratorias normalmente más bajas da lugar a pulmonía. Alternativamente, las bacterias pueden diseminarse en el torrente sanguíneo causando bacteriemia, que se asocia con altas tasas de mortalidad2,o bien conducir directamente al desarrollo de meningitis neumocócica. La comprensión de la cinética de, y las respuestas inmunes a, colonización nasofaríngea es un aspecto importante de los modelos de la infección de los pneumoniae del S.

Nuestro modelo murino de colonización intranasal está adaptado de los modelos humanos3 y ha sido utilizado por múltiples grupos de investigación en el estudio de las respuestas huésped-patógeno en la nasofaringe4-7. En la primera parte del modelo, utilizamos un aislado clínico de S. pneumoniae para establecer una colonización bacteriana autolimitada que es similar a los eventos de transporte en adultos humanos. El procedimiento detallado aquí implica la preparación de un inóculo bacteriano, seguido por el establecimiento de un evento de colonización con la entrega del inóculo vía una ruta intranasal de la administración. Los macrófagos residentes son el tipo de célula predominante en la nasofaringe durante el estado estacionario. Típicamente, hay pocos linfocitos presentes en ratones no infectados8,sin embargo, la colonización de la mucosa conducirá a una inflamación de bajo a alto grado (dependiendo de la virulencia de la especie bacteriana y la cepa) que resultará en una respuesta inmune y el posterior reclutamiento de células inmunes del huésped. Estas células pueden ser aisladas por un lavado del contenido traqueal a través de las narinas, y correlacionadas con la densidad de las bacterias de colonización para comprender mejor la cinética de la infección.

Protocol

Antes de comenzar: todos los pasos se realizan en un Gabinete de Seguridad Biológica (BSC) de Nivel 2 de Riesgo Biológico (BSL2) a menos que se indique lo contrario. Asegúrese de haber obtenido la aprobación de riesgo biológico apropiada para el uso de patógenos bacterianos infecciosos según las directrices institucionales antes del inicio de los experimentos. Además, asegúrese de tener todos los materiales y reactivos necesarios para llevar a cabo el procedimiento preparado de antemano. Los rat…

Representative Results

La figura 1 representa un esquema general que resume los pasos principales del protocolo. Las figuras 2-3 proporcionan una visualización de la metodología microbiológica inherente a los protocolos aquí descritos. La Figura 4 representa el posicionamiento adecuado de un ratón para realizar una colonización intranasal, mientras que la Figura 5 representa típicamente los cambios en el peso de los ratones colonizados con S. pneumoniae cepa P1…

Discussion

En este estudio se presentaron métodos detallados para la colonización intranasal de ratones utilizando una cepa aislada clínica de Streptococcus pneumoniae y el posterior aislamiento y caracterización de las células inmunes reclutadas a la nasofaringe en respuesta a las bacterias. Demostramos cómo un inóculo bacteriano puede ser cultivado en medios ricos en nutrientes y utilizado para establecer un evento de colonización en ratones, que inicialmente se restringe a la nasofaringe. Luego mostramos cómo l…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer al Dr. Jeffery Weiser de la Universidad de Pennsylvania por su regalo de las cepas clínicas de Streptococcus pneumoniae. Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. CV fue financiado por una beca M. G. DeGroote y una beca de la Sociedad Torácica Canadiense. Este trabajo fue financiado por la Asociación de Pulmón de Ontario y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). El trabajo en el laboratorio Bowdish es apoyado en parte por el Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research y el McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26G3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001
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Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).
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