Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells
Summary
In deze publicatie beschrijven we een snelle en gemakkelijke werkwijze voor het isoleren en kweken van primaire acinaire cellen van de pancreas muizen. Deze methode vormt een waardevolle benadering van de fysiologie van verse primaire normale / getransformeerde exocriene pancreas cellen te bestuderen.
Abstract
Dit protocol maakt snelle isolatie (minder dan 1 uur) van muizen pancreas acini, waardoor ze in kweek te handhaven gedurende meer dan een week. Meer dan 20 x 10 6 acinaire cellen kunnen worden verkregen uit een muis alvleesklier. Dit protocol biedt de mogelijkheid om zelfstandig liefst 10 pancreases verwerken parallel. Omdat behoudt acinaire architectuur, dit model geschikt voor het bestuderen van de fysiologie van de exocriene pancreas in vitro in tegenstelling tot cellijnen van pancreatische tumoren, die vele genetische veranderingen waardoor geheel of gedeeltelijk verlies van hun acinaire differentiatie tonen.
Introduction
Een vaak voorkomend probleem voor onderzoekslaboratoria aan exocriene pancreas weefsel is de moeilijkheid kweken acinaire cellen in vitro gedurende een periode die lang genoeg is om een lange-termijn experiment mogelijk.
Een factor belemmert de ontwikkeling van dergelijke kweeksystemen is de intrinsieke gevoeligheid van pancreatische weefsel experimentele manipulatie vanwege het hoge gehalte in glycolytische, proteolytische en lipolytische enzymen, die letterlijk verteren de pancreas weefsel wanneer ze vrijkomen bij de isolatie van pancreatische cellen.
Een tweede factor is het opmerkelijk vitro plasticiteit van acinaire cellen, die de neiging hebben om hun secretie kenmerken verliezen en transdifferentiate andere rijpe cellen, zoals pancreatische ductale cellen of hepatocyt-achtige cellen 1. In vitro, heeft deze plasticiteit is afhankelijk van de experimentele condities (zoals kweekmedium samenstelling) 2 </sup> en introduceert een mate van complexiteit in het ontwerp van geschikte kweekomstandigheden voor exocriene pancreas cellen 1.
Verscheidene werkwijzen zijn ontwikkeld voor de isolatie en kweek van acinaire cellen, eerst van de cavia pancreas 3-5. In eerste instantie, deze protocollen betrokken vertering van pancreas weefsel met collagenase, chymotrypsine, en een protease cocktail, met de uiteindelijke isolatie door krachtige mechanische dissociatie. De pancreatische cellen die op deze wijze getoond abnormale structurele en functionele kenmerken, met name een verlies van apicale structuren en aanzienlijke schade aan de membraanreceptoren. Geïsoleerde cellen in stand bleef voor slechts 1 of 2 dagen.
Voorbereiding van verspreide acini onderhoudt hun intra-en intercellulaire architectuur, behoud van celmembranen, beperken van schade aan de oppervlakte receptoren, en daarmee het verbeteren van exocriene secretie als respons op secretagogen 6-8. Als een automalt, deze methode biedt het grote voordeel van acinar levensvatbaarheid van de cellen uit te breiden tot 7-10 dagen in vitro. Bovendien is deze methode nog liever acinaire cellen geïsoleerd 9-12 vanwege onderhoud van intercellulaire contacten, waaronder mobiele koppeling gap junctions, is een essentiële factor van de exocriene acinaire cel-fenotype 13.
Aangezien de dedifferentiatie van acinaire cellen en hun transdifferentiatie ductale cellen is een van de voorgestelde mechanismen voor het ontstaan van agressieve exocriene pancreas kanker 14 de gedispergeerde acini model ook een adequaat systeem alvleesklier plasticiteit en de daaropvolgende moleculaire mechanismen te bestuderen. Verder in combinatie met het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren 15,16 en de ontwikkeling van technieken voor genoverdracht (2 adenovirale of lentivirale transductie, nanodeeltjes worden gebruikt, enz.), dit in vitro primaire acinaire cellen bij kanzeer nuttig zijn om te bepalen hoe verschillende genetische disfuncties de regelingen inzake acinaire cel differentiatie of dedifferentiatie en dienen beter begrip van de moleculaire gebeurtenissen die verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van pancreatitis, precancereuze letsels en veranderingen in cel plasticiteit.
Isolatie van verspreide acini is de aanpak die we gebruiken in ons laboratorium om cultuur acinaire cellen. We beschrijven hier en discussiëren over de gebruikte methode. Het gaat enzymatische dissociatie van pancreatische weefsel (met bacterieel collagenase) gekoppeld met mechanische verbreking zonder dissociatie van acinaire cellen. Terwijl de meeste protocollen betrekking hebben op het kweken van de acini, hetzij in suspensie of op speciaal behandelde plastic substraten, we groeien ze in suspensie slechts kort (voor 24 uur), daarna zaaien ze op een matrix steigers wanneer langdurige celcultuur vereist.
Dit protocol maakt een snelle isolatie (minder dan 1 uur) van gedispergeerde ac alvleesklierini, duurzaam is voor meer dan een week in de cultuur. Het maakt isolatie van meer dan 20 x 10 6 acinaire cellen per muis alvleesklier. De eenvoud maakt het mogelijk om onafhankelijk verwerken liefst 10 alvleesklier in parallel. Door het handhaven van de intra-en intercellulaire architectuur van acini en daarmee de acinaire fenotype van geïsoleerde primaire cellen, dit model is een systeem waar de studie van transdifferentiatie mechanismen, zoals alle andere exocriene pancreas thans beschikbare modellen zijn afgeleid van de pancreas tumoren weergeven vele genetische veranderingen leidt tot cellulaire transformatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren acinaire cellen. Deze methode maakt het mogelijk om meer dan 20 x 10 6 acinaire cellen per dier isoleren in minder dan 1 uur. Dankzij de snelle en eenvoudige implementatie (maar liefst 10 pancreases kan onafhankelijk per experiment parallel worden verwerkt), lijkt dit protocol als een goed compromis tussen de bestaande isolatie methoden 3-5,9-12,17.
Kritische stappen / Trouble-shooting
<p class=…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het personeel van AniCan (CRCL, Lyon) voor hun technische bijstand met de verzorging van dieren. Dit werk werd ondersteund door het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM Avenir Program), de Ligue Nationale Contre le Cancer, door de Association pour la Recherche sur le Cancer, door het Institut National du Cancer, en door beurzen uit de Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), van het Institut National du Cancer (JG), van het Ministère de l'Enseignement Superieur et de la Recherche van Frankrijk (RMP en DFV) en van de Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Riferimenti
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
