Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule
Summary
In questa pubblicazione, si descrive una procedura rapida e conveniente per l'isolamento e la coltura primaria cellule pancreatiche acinose del pancreas murino. Questo metodo costituisce un valido approccio per studiare la fisiologia delle cellule esocrine del pancreas freschi primarie normali / non trasformata.
Abstract
Questo protocollo permette isolamento rapido (in meno di 1 ora) di acini pancreas murino, rendendo possibile mantenerli in coltura per più di una settimana. Più di 20 x 10 6 cellule acinose possono essere ottenuti da un singolo pancreas murino. Questo protocollo offre la possibilità di elaborare separatamente ben 10 pancreases in parallelo. Perché conserva architettura acinose, questo modello è adatto per studiare la fisiologia del pancreas esocrino in vitro in contrasto con linee cellulari stabilizzate da tumori pancreatici, che visualizzano molte alterazioni genetiche conseguente perdita parziale o totale della loro differenziazione acinose.
Introduction
Un problema riscontrato frequentemente per laboratori di ricerca lavorano su tessuto pancreatico esocrino è la difficoltà di coltivare cellule acinose in vitro per un periodo di tempo sufficientemente lungo da consentire un esperimento a lungo termine.
Un fattore impedendo lo sviluppo di tali sistemi di coltura è la sensibilità intrinseca del tessuto pancreatico di manipolazione sperimentale a causa dell'elevato contenuto di glicolitiche, proteolitica e lipolitica enzimi, che letteralmente digeriscono il tessuto pancreatico quando vengono rilasciate durante l'isolamento delle cellule pancreatiche.
Un secondo fattore è la notevole plasticità in vitro di cellule acinose, che tendono a perdere le loro caratteristiche secretorie e transdifferenziarsi ad altre cellule mature, quali le cellule pancreatiche duttali o cellule epatociti-simili 1. In vitro, questa plasticità cella varia con le condizioni sperimentali (come composizione mezzo di coltura) 2 </sup> e introduce un grado di complessità nella progettazione di condizioni di coltura appropriati per le cellule pancreatiche esocrine 1.
Diversi metodi sono stati sviluppati per l'isolamento e la coltura di cellule acinose, prima della cavia pancreas 3-5. Inizialmente, tali protocolli coinvolti digestione del tessuto pancreatico con collagenasi, chimotripsina, e un cocktail proteasi, con l'isolamento definitivo da vigoroso dissociazione meccanica. Le cellule pancreatiche isolate in questo modo visualizzati caratteristiche strutturali e funzionali anomale, in particolare una perdita di strutture apicali e danni significativi ai loro recettori di membrana. Cellule isolate rimaste vitali per solo 1 o 2 giorni.
Preparazione di disperso acini mantiene la loro architettura intra-e intercellulare, preservando le membrane cellulari, limitando i danni ai recettori della superficie, e quindi migliorando la secrezione esocrina in risposta ai secretagoghi 6-8. Come result, questo metodo offre il grande vantaggio di estendere vitalità cellulare acinose per 7-10 giorni in vitro. Inoltre, questo metodo viene attualmente preferito isolamento delle cellule acinose 9-12 perché la manutenzione dei contatti intercellulari, tra accoppiamento cellula per giunzioni, è un determinante essenziale del pancreatica esocrina acinoso fenotipo delle cellule 13.
Come dedifferentiation delle cellule acinose e la loro transdifferenziazione di cellule duttali è uno dei meccanismi proposti per la genesi di tumori del pancreas esocrino aggressivi 14, il modello disperso acini è anche un sistema adeguato per studiare plasticità pancreatica e successive meccanismi molecolari. Inoltre, in combinazione con l'uso di animali geneticamente modificati 15,16 e lo sviluppo di tecniche di trasferimento genico (2 adenovirale o trasduzione lentivirale, uso di nanoparticelle, etc), questo modello in vitro cellule acinose primario puòessere molto utile per determinare come le varie disfunzioni genetiche influenzano la regolazione della differenziazione delle cellule acinose o de-differenziazione e dovrebbero fornire una migliore comprensione degli eventi molecolari responsabili della insorgenza di pancreatite, lesioni precancerose, e cambiamenti nella plasticità delle cellule.
Isolamento dei dispersi acini è l'approccio che usiamo nel nostro laboratorio di cultura pancreatiche cellule dell'acino. Siamo qui descriviamo e discutiamo il metodo utilizzato. Esso comporta dissociazione enzimatica del tessuto pancreatico (con collagenasi batterica) accoppiato a rottura meccanica senza dissociazione delle cellule acinose. Mentre la maggior parte dei protocolli prevedono la coltura degli acini, in sospensione o su substrati plastici appositamente trattati, li cresciamo in sospensione solo brevemente (per 24 ore), la semina loro in seguito su scaffold di matrice se è richiesta la coltura cellulare prolungato.
Questo protocollo permette isolamento rapido (in meno di 1 ora) di dispersi pancreatica acini, sostenibile per più di una settimana di cultura. Esso consente l'isolamento di più di 20 x 10 6 cellule acinose al pancreas mouse. La sua semplicità consente di elaborare in modo indipendente fino a 10 pancreas in parallelo. Mantenendo l'architettura intra-e intercellulare di acini e quindi il fenotipo di cellule acinose primarie isolate, questo modello costituisce un sistema di scelta per lo studio dei meccanismi transdifferenziazione, come tutti gli altri modelli pancreas esocrino attualmente disponibili sono derivate da tumori pancreatici visualizzare molte genetica alterazioni porta alla trasformazione cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, si descrive una procedura per isolare le cellule acinose pancreatiche. Questo metodo rende possibile isolare più di 20 x 10 6 cellule acinose per animale in meno di 1 ora. Grazie alla sua attuazione rapida e semplice (ben 10 pancreas possono essere trattati in modo indipendente per ogni esperimento in parallelo), questo protocollo viene visualizzato come un buon compromesso tra i metodi di isolamento esistenti 3-5,9-12,17.
Passaggi critici / r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo lo staff di AniCan (CrCl, Lione), per la loro assistenza tecnica con la cura degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), la Ligue Nationale contre le Cancer, dall'Associazione pour la Recherche sur le Cancer, dall'Institut National du Cancer, e da borse di studio da la Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), presso l'Institut National du Cancer (JG), dal Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche di Francia (RMP e DFV) e dalla Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Riferimenti
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