Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür
Summary
Bu yayında, böylece yalıtma ve sıçangil pankreas kültür birincil pankreatik acinar hücreleri için bir hızlı ve uygun bir prosedürü açıklar. Bu yöntem taze birincil dönüştürülmemiş / Normal ekzokrin pankreas hücrelerinin fizyolojisi incelemek için değerli bir yaklaşım oluşturmaktadır.
Abstract
Bu protokol, bu birden fazla olası hafta bunların kültür korumak için yapmak, kemirgen pankreas asinüs hızlı izolasyonu (en az 1 saat olarak) izin verir. En az 20 x 10 6 asiner hücrelerin, tek bir sıçangil pankreasından elde edilebilir. Bu protokol bağımsız paralel 10 gibi pankreaslarında işlemek için imkan sunuyor. Bu asiner mimarisi korur, çünkü bu model de kendi asiner farklılaşma kısmen veya tamamen kaybı ile sonuçlanan birçok genetik değişiklikler görüntülemek pankreas tümörleri, gelen kurulan hücre hatları aksine in vitro pankreas fizyolojisi eğitim için uygundur.
Introduction
Ekzokrin pankreas dokusu üzerinde çalışan araştırma laboratuvarları için sık karşılaşılan sorun yeterince uzun uzun vadeli bir deneme sağlamak için bir süre için in vitro asiner hücrelerin yetiştirilmesi zorluğudur.
Bu tür kültür sistemlerinin geliştirilmesi engelleyen bir faktör de pankreas hücrelerinin izolasyonu sırasında serbest zaman tam anlamıyla pankreas doku sindirmek, glikolitik proteolitik ve lipolitik enzimler, en yüksek içeriği nedeniyle deneysel manipülasyon için pankreas dokusunun içsel duyarlılığı.
İkinci bir faktör, salgı özelliklerini yitirmesine ve bu pankreatik duktal hücreleri veya hepatosit benzeri hücreler 1. Gibi diğer olgun hücrelerin, için transdifferentiate eğilimi asiner hücreler, in vitro plastisitede dikkat çekicidir in vitro olarak, bu hücre plastisite deneysel koşullar ile değişir (örneğin, kültür ortamının bileşimi gibi) 2 </> destek ve ekzokrin pankreas hücreleri 1 için uygun kültür şartları ile içine karmaşıklığı bir ölçüde tanıttı.
Birçok yöntem ilk kobay pankreas asinar 3-5, hücrelerin izolasyonu ve kültürü için geliştirilmiştir. Başlangıçta, bu protokoller güçlü mekanik ayrışma ile nihai yalıtımlı, kollajenaz, kimotripsin ve bir proteaz kokteyl ile pankreas doku sindirim çıkıyor. Bu şekilde izole edilmiş pankreas hücreleri, özellikle anormal yapısal ve işlevsel özellikleri, apikal yapıları ve membran reseptörlerine önemli hasar bir kayıp gösterdi. İzole hücreler sadece 1 ya da 2 gün boyunca yaşayabilecek durumda kalır.
Hazırlanması asinüs salgı 6-8 cevaben yüzeyi reseptörlerine hasar görmesini sınırlayarak, ve böylece ekzokrin salgılanması iyileştirilmesi, hücre zarı koruyarak, bunların hücre içi ve arası mimari korur dağıldı. Bir resu olarakLT, bu yöntem, in vitro olarak 7-10 gün asinar hücre canlılığı uzanan en önemli avantaj sağlar. Gap junction ile hücre bağlantısı da dahil olmak üzere hücreler arası iletişim, bakımı ekzokrin pankreas asiner hücre fenotip 13 önemli bir belirleyicisi olduğu için Ayrıca, bu yöntem şu anda 9-12 asiner hücre izolasyonu için tercih edilir.
Asiner hücreler ve duktal hücrelerine kendi transdiferansiasyon en dediferansiyonunu agresif ekzokrin pankreas kanserleri 14 doğuşu için önerilen mekanizmalardan biri olduğu için, dağınık acini modeli aynı zamanda pankreas plastisite ve sonraki moleküler mekanizmaları incelemek için yeterli bir sistemdir. Ayrıca, genetik olarak değiştirilmiş hayvanların 15,16 kullanımı ve gen transfer tekniklerinin geliştirilmesi (adenoviral 2 veya lentiviral transdüksiyon, nanopartiküller, vb kullanımı), ile birlikte bu vitro birincil asiner hücre modelinde yapabilirsinizçeşitli genetik bozukluklar asiner hücre farklılaşması veya dediferansiyonunu düzenlenmesi etkiler ve pankreatit başlangıcı, prekanseröz lezyonlar, ve hücre plastisite değişiklikler sorumlu moleküler olayların daha iyi anlaşılmasını sağlamak nasıl belirlemede çok yararlı olabilir.
Dağınık acini izolasyonu biz kültür pankreas asiner hücrelere Laboratuvarımızda kullandığımız yaklaşımdır. Biz burada açıklamak ve kullanılan yöntemi tartışmak. Bu asiner hücre ayrışma olmadan mekanik bozulmasına birleştiğinde pankreas doku (bir bakteri kollajenazlarla) enzimatik ayrışma içerir. En protokoller süspansiyon veya özel işleme tabi tutulan plastik yüzeylerde ya kültür acini, dahil ederken, uzun süreli hücre kültürü gerekli ise matris iskeleleri üzerine sonradan tohumlama, sadece kısa bir süre (24 saat) süspansiyon bunları büyür.
Bu protokol dağınık pankreas ac hızlı izolasyonu (az 1 saat içinde) sağlarini, kültür birden fazla hafta sürdürülebilir. Bu fare pankreası başına en fazla 20 x 10 6 asiner hücrelerin izolasyonu sağlar. Sadeliği mümkün bağımsız paralel olarak 10 gibi pankreaslarında işlemek için yapar. Mevcut diğer tüm ekzokrin pankreas modelleri birçok genetik gösteren pankreas tümörleri türetilen gibi asini içi ve hücreler arası mimari ve böylece izole primer hücrelerin asiner fenotip koruyarak, bu model, transdiferansiasyon mekanizmalarının çalışma için tercih edilen bir sistem oluşturur Değişiklik hücresel dönüşüme yol açar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, pankreas asiner hücreleri izole etmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu yöntem, en az 1 saat, hayvan başına en fazla 20 x 10 6 asiner hücreleri izole etmek mümkün kılar. Hızlı ve basit bir uygulama (10 gibi pankreaslarında bağımsız paralel Deneme başına işlenebilir) sayesinde, bu protokol mevcut izolasyon yöntemleri 3-5,9-12,17 arasında iyi bir uzlaşma olarak görünür.
Kritik adımları / Sorun Giderme
<p class="j…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz hayvan bakımı ile teknik yardım için AniCan personeli (CrCl, Lyon) teşekkür ederim. Bu çalışma Derneği pour la Recherche sur le Kanser tarafından, Institut National du Kanser tarafından ve burs tarafından Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Programı), Ligue Nationale Contre le Kanser, tarafından desteklenmiştir Fransa'nın Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche gelen Institut National du Kanser (JG), (RMP ve DFV) gelen ve Derneği pour la Recherche sur le Kanser Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Riferimenti
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
