Şiddetli Spinal Kord Yaralanması sonra fibrin ve Büyüme Faktörü kokteyller ile Nöral Kök Hücre Survival ve Farklılaşma Tanıtım
Summary
Büyüme faktörlerini içeren fibrin matrisi tam omurilik kesisi sitelerine aşılı nöral kök hücrelerini korumak için kullanılmıştır. Aşılı hücreler tamamen lezyon boşluğu doldurdu ve uzun mesafelerde konak omuriliğe aksonlarını uzatıldı nöronlar da dahil olmak üzere birden fazla nöral hücre tipleri, ayrışmıştır.
Abstract
Nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve nöronlar ve glia içine ayırt edebilirsiniz. Nakledilen NSC'lerde spinal kord yaralanması (SKY) sonra kaybolan nöronlar ve glia değiştirebilirsiniz, ve bir lezyon üzerinde ve altında omurilik segmentleri yeniden bağlamak için fonksiyonel röleleri oluşturabilir. Nöral kök hücreler aşılama Önceki çalışmalar, spinal kord lezyon boşluğuna içinde eksik greft sağ kalımı ile sınırlı kalmıştır. Ayrıca, greft hücre canlılığı, farklılaşması, ve süreç uzatma izleme optimize olmasaydı. Son olarak, önceki çalışmalarda, kültürlü sıçan NSC'lerde genellikle kader belirli bir hücre tipine sürüldü sürece, yerine nöronların daha yaralı omurilik, aşılı zaman Gliadaki içine ayırt etmek bildirildi. Bu sorunları çözmek için, hatta şiddetli SCI sitelerine NSC'lerde yaşam, entegrasyon ve farklılaşmayı artırmak için yeni yöntemler geliştirdi. NSC'lerde taze yeşil fl eksprese eden stabil bir transgenik Fischer 344 sıçan çizgisinden embriyonik gün 14 omurilik (E14) izole edilmiştiruorescent protein (GFP) ve büyüme faktörlerini içeren bir fibrin matrisi içine gömülü edildi; Lezyon boşluğunda aşılı hücreleri korumak ve hücre yaşamını destekleyen amaçlanmıştır, bu formülasyon. Fibrin / büyüme faktörü kokteylinde NSC'lerde böylece inflamasyon tepe sürelerinin önüne, iki hafta torasik seviye-3 (T3) tam omurilik kesilerde sonra implante edildi. Ortaya çıkan greft tamamen lezyon boşluğu doldurdu ve konak spinal oldukça uzun mesafelerde kablosu ve glia içine aksonlarını genişletilmiş hem de nöronların, ayrışmıştır. GFP ifade kültürlü insan NSC'lerde greft benzer bulgularla sonuçlanmıştır. Bu nedenle, yöntem nöral kök hücre aşılama, hayatta kalmasını ve in vivo bulguların analiz geliştirmek için tanımlandığı gibidir.
Introduction
Spinal kord yaralanması (SKY) genellikle zarar değil sadece internöronlar ve motor nöronların segmental kaybına neden beyne ve sinyaller taşıyan beyaz madde yolları, aynı zamanda merkezi gri madde. SCI sonucu motor ve lezyon altındaki duyusal fonksiyonu hem kaybıdır. Ne yazık ki, yetişkin merkezi sinir sistemi (CNS) kendiliğinden sürekli işlevsel bozukluklarının 1 'de elde edilen, yeniden değildir. Bu nedenle, yaralı yetişkin omurilik ve iyileştirme motor, duyusal ve otonomik fonksiyon yeniden SCI araştırmanın önemli bir hedeftir. Nöral kök hücreler (NSC'lerde), doğrudan embriyonik veya yetişkin CNS izole edip, kayıp nöronlar ve glia değiştirmek için zorlayıcı aday hücrelerdir. Ayrıca, bu hücreler, lezyon Alanı 2,3 arasında aksonal yeniden iletimi için yeni bir fonksiyonel röleleri oluşturmak için potansiyele sahiptir.
Bugüne kadar, anatomik ayrıntılı bir aydınlatılması, electrophys olmamıştıriological ve ağır yaralanmasından sonra nakledilen NSC'lerde nöronal röle oluşumu davranışsal etkileri. İlk, nakledilen NSC'lerde veya fetal MSS doku geniş lezyon boşlukları içine aşılı zaman kötü hayatta: Bunun birkaç nedeni vardır. Önceki çalışmalar büyük boş kistik lezyon boşluklannın, 4,5 bırakarak, önemli bir erken hücre kaybı göstermektedir. Bazı çalışmalarda aşılanan hücrelerin sonradan bölmek ve lezyon oyuk, 4,5 doldurun, ama bu hafta gün gecikmeden sonra oluşabilir ve sonraki lezyon sitesi dolum tam veya tutarlı olmayabilir olacaktır. İkincisi, hücresel hayatta kalma, farklılaşma / olgunlaşması ve nakledilen NSC'lerde akıbet ses verileri sağlar verimli bir izleme sistemi yoktu. En erken çalışmalar antegrad ve nakilleri 2,3 dan aksonal projeksiyonlar iz retrograd etiketleme kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu teknikler sadece kısmen ve çoğu zaman açık olmayan işaretli aksonal aşılanmış hücrelerden kaynaklanan çıkıntılar ve izleme yöntemleri vardır subjekimplante hücrelerin ötesine boya sızıntıdan kaynaklanan eserler için t. Diğer gruplar yaralı kemirgen omurilik 5,6, insan fetal NSC'lerde naklinden sonra aksonal projeksiyonlar etiketlemek için insan spesifik nöronal belirteçler kullanılır. Ancak, bu çalışmalarda, ksenogratflardır sürekli iyi hayatta değildi. Son zamanlarda, GFP raportör genin viral teslim kültürlenmiş NSCs 7,8 etiketlemek için kullanıldı. Bununla birlikte, GFP ifade genellikle tutarsız ve 7, aşağı-regüle edilebilir. Son zamanlarda, stabil bir şekilde, raportör geni, GFP veya insan plasental alkali fosfataz ifade eden transjenik fareler ya da donör sıçanların kullanılması önemli ölçüde, in vivo 9,11 transplante nöral kök hücre / progenitörlerin izleme geliştirdi. Üçüncü olarak, bazı çalışmalar, dokunulmamış ya da yaralı yetişkin omurilik cor ortamına transplante zaman embriyo veya yetişkin ya da CNS türetilen in vitro kültürlenmiş sıçan NSC'lerde sadece glial soy içinde farklılık gösterirBu nöral kök hücreler, yerel ortamlarında kök hücrelerin kaderini belirleyebilir belirten nöronların ve in vitro glial hem de farklılaşma yeteneğine sahip olmasına rağmen d 7,12,13. Alternatif olarak, kültürlü NSC'lerde, yetişkin CNS türetilmiş özellikle, in vivo 13 glial soy içine ayırt etmek için içsel defaulty özelliğine sahip olabilir.
Çünkü yukarıda tartışılan sınırlamaları, bizim grup son zamanlarda ağır yaralı erişkin omurilik embriyonik MGK izleme, hayatta kalma ve farklılaşma / olgunlaşmasını geliştirmek için yeni bir protokol geliştirdi. Kısaca, bizler, in vivo nakli 14 sonra GFP ifade sürdüren bir GFP raportör geni ifade eden stabil bir transgenik fare Kendilenmiş Fischer 344 hattı ile başladı. Sonra, embriyonik günden itibaren 14 Fischer 344 omurilik, nöronlar ve glia üretmek hem de potansiyelini koruyan bir gelişme aşamasına taze izole NSCs kullanılır. Son olarak, gömülübüyümeyi içeren bir fibrin matriks içine taze ayrışmış NSC'lerde hücrelerini korumak ve eşit greft hücre yaşama, farklılaşma ve entegrasyonu desteklemek amacıyla, büyük bir lezyon boşluğuna içinde onları dağıtmak için 15-17 faktörleri. Greftler T3 tam Transeksiyon, omurilik yaralanması sonrası iki haftalık sitelerine yerleştirildi. Bu aşılı hücreler sürekli tam transeksiyonu siteleri dolu ve uzun mesafelerde 18 üzerinden barındıran omurilik içine akson çok sayıda genişletilmiş bol nöronların içine farklılaşmış. Benzer sonuçlar bağışıklık-eksikli fareler 18 kültürlenmiş insan nöral kök hücre nakli kullanılarak elde edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaralı omurilik MGK nakli için önemli engellerden biri lezyon merkezinde yoksul hayatta kalabilmek. Lezyon yerinde herhangi bir boşluk veya boşluklar potansiyel olarak azaltmak veya supraspinal akson ve yaralanma altında ayrılmış spinal kord segmentleri arasında fonksiyonel nöronal röleleri oluşumunu zayıflatabilir. Ek olarak, aşılanmış NSC'lerde zayıf yaşama konak doku ile entegrasyonu etkiler ve bu nedenle ana nöronlar ile aşılanmış nöronların bağlantı azaltabilir. Hücre kaybını aç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Rat Kaynak ve Araştırma Merkezi teşekkür, Missouri Üniversitesi, Columbia, Missouri, GFP fareleri sağlamak için; Insan sinir kök hücreleri sağlamak için Neuralstem Inc. Bu çalışma Gaziler İdaresi, NIH (NS09881), Kanada Spinal Araştırma Örgütü, Craig H. Neilsen Vakfı, ve Bernard ve Anne Spitzer Charitable Trust tarafından desteklendi.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
