Separation av spermatogenesisk celltyper med STA-PUT Velocity Sedimente
Summary
STA-PUT metod möjliggör för separation av olika populationer av spermatogeniska celler baserat på storlek och täthet.
Abstract
Däggdjurs spermatogenesen är en komplex differentiering process som sker i flera steg i sädeskanalerna i testiklarna. För närvarande finns det inga tillförlitliga cellodlingssystem möjliggör spermatogenesisk differentiering in vitro, och de flesta biologiska studier av spermatogenescykler celler kräver vävnad skörd från djurmodeller såsom mus och råtta. Eftersom testiklarna innehåller många celltyper – både icke-spermatogenesisk (Leydig, Sertoli, myeloid och epitelceller) och spermatogenescykler (spermatogonier, spermatocyter, runda spermatider, kondensespermatider och spermier) – studier av de biologiska mekanismer som är inblandade i spermatogenes kräver isolering och anrikning av dessa olika celltyper. STA-PUT metod möjliggör för separation av en heterogen population av celler – i detta fall, från testiklarna – genom en linjär BSA-gradient. Individuella celltyper sediment med olika sedimenteringshastighet enligt cell storlek och fraktioner anrikade med avseende på olika celltyper som kan samlas in och användas i vidare analyser. Medan STA-PUT metod inte resulterar i mycket rena fraktioner av celltyper, t.ex. som kan erhållas med vissa cellsorteringsmetoder, men det ger ett mycket högre utbyte av totala celler i varje fraktion
(~ 1 x 10 8 celler / spermatogenesisk celltyp från en start befolkning på 7-8 x 10 8 celler). Denna höga avkastning metoden kräver endast specialiserade glas och kan utföras i något kylrum eller stort kylskåp, vilket gör det till en idealisk metod för labb som har begränsad tillgång till specialutrustning som en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) eller elutriatorn.
Introduction
Däggdjurs spermatogenesen är en komplex differentiering process som sker i flera steg i sädeskanalerna i testiklarna 1. Kortfattat, stem-like spermatogonier att uppe nära epitelet sädeskanalens tubulus klyftan och differentiera till spermatocyter, vilka sedan genomgår meiotiska delningar. Efter meios är klar, de resulterande haploida celler, eller runda spermatider, genomgår spermiogenesen, en differentieringsprocess som involverar avgivande av cytoplasman och kompaktering av kärnan. Spermatider successivt utveckla en flagellum och genomgå töjning och kondensering av kärnan, som producerar förlängning och sedan kondensespermatider, respektive. Slutprodukterna är spermatozoer, som släpps in i lumen sädeskanalens tubulus och slutligen in epididymis där de mognar ytterligare.
Eftersom processen av spermatogenesen är beroende av speciella hormonella och molekylära förhållanden itestiklarna, en pålitlig odling in vitro-system för hela processen av spermatogenes har ännu inte utvecklats 2,3. Odlingsmetoder har utvecklats för att skapa "primordial könscellsliknande celler" och haploida, "runda spermatid-liknande celler" från stamceller, men dessa metoder är ännu inte kan generera stort antal av dessa celler och misslyckas med att producera senare spermatogenesisk cell typer 4,5. Lyckligtvis spermatogenescykler celltyper skiljer sig avsevärt i storlek, vilket gör det möjligt för en encelliga fjädring erhållits från hela testiklarna att separeras med en vätska lutning. STA-PUT-metod, visade här, använder en linjär BSA-gradient och enkel sedimentering för att separera spermatogeniska celler baserat på storlek och massa 6-9.
STA-PUT metod har flera fördelar jämfört med de andra två mest använda metoderna för att åtskilja spermatogeniska celltyper: FACS och elutriation 10-13. STA-PUT apparat kräver only flera stycken av specialiserade glas monterat i ett kallt rum eller stort kylskåp. Sålunda är det billigare än att använda en cellsorterare eller en elutriatorn. STA-PUT metod ger större mängder av celler per celltyp och testis än kan sorteras genom FACS i en jämförbar tidsram, även om renheten hos varje cellpopulation är inte lika höga som de som erhölls med FACS-11. Cellsortering utnyttjar magnetiska kulor (magnetisk aktiverad cellsortering, MACS) har nyligen framgångsrikt använts för anrikning av spermatogonier från en blandad testikelcellpopulation, men det är för tillfället olämpligt för att separera spermatocyter eller spermatider på grund av bristande kunskap om lämplig yta markörer 14. En ytterligare fördel med STA-PUT-metod under FACS eller MACS är förmågan att isolera livsdugliga celler som är lämpliga för efterföljande kultur, eftersom det i motsats till de flesta FACS-protokoll, behöver den inte någon DNA-eller andra typer av färgning. För studier som kräver lArge avkastning av spermatogenescykler celltyper vid ~ 90% renhet, är det STA-PUT en idealisk metod.
Protocol
Representative Results
Discussion
De som studerar spermatogenes beroende av djurmodeller för spermatogenescykler cellprover, som en pålitlig cellodlingssystem ännu inte existerar för att generera alla spermatogenescykler celltyper 3. Även spermatogenescykler celler lätt samlas in från hela testiklar, resulterar endast en blandad befolkning. Detta innebär ett problem för dem som vill studera specifika subtyper av dessa celler, såsom meiotiska celler, runda spermatider och kondensespermatider. Tre olika metoder används för närvaran…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av NIH bidrag GM055360 till SLB och U54HD068157 till RGM. JMB stöddes av T32 Genetics utbildningsstipendium vid University of Pennsylvania (GM008216).
Materials
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher | ||
Riferimenti
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
- Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
- Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
- Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
- Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
- Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
- Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
