Разделение сперматогенного Типы клеток с использованием STA-PUT скорости осаждения
Summary
Способ STA-PUT позволяет для разделения различных популяций клеток сперматогенных в зависимости от размера и плотности.
Abstract
Млекопитающих сперматогенез представляет собой сложный процесс дифференциации, что происходит в несколько этапов в семенных канальцах яичек. В настоящее время нет надежной системы культуры клеток позволяет сперматогенного дифференциации в пробирке, и большинство биологические исследования сперматогенных клеток требуют урожай тканей от животных моделях, таких как мыши и крысы. Потому что яичко содержит многочисленные типы клеток – как не-сперматогенеза (Лейдига, Сертоли, миелоидных и эпителиальные клетки) и сперматогенеза (сперматогенов сперматоциты, круглые сперматиды, конденсации сперматиды и сперматозоиды) – изучение биологических механизмов, участвующих в сперматогенеза требуют изоляции и обогащение этих различных типов клеток. Метод СТА-PUT позволяет для разделения гетерогенной популяции клеток – в данном случае, от яичек – через линейным градиентом BSA. Отдельные типы клеток осадок с разной скоростью осаждения в соответствии с серазмер LL, и фракции, обогащенные для различных типов клеток могут быть собраны и использованы в дальнейших анализов. Хотя способ STA-PUT не приводит к чрезвычайно чистых фракций из типов клеток, например, как могут быть получены с определенными методами сортировки клеток, он обеспечивает значительно более высокий выход общего числа клеток в каждой фракции
(~ 1 х 10 8 клеток / сперматогенеза тип клеток из исходного населения 7-8 х 10 8 клеток). Этот метод высокая доходность требует только специализированные изделия из стекла и может быть выполнена в любом холодном помещении или большой холодильник, что делает его идеальным методом для лабораторий, которые имеют ограниченный доступ к специализированным оборудованием вроде активацией флуоресценции сортировщика клеток (FACS) или элюент.
Introduction
Млекопитающих сперматогенез представляет собой сложный процесс дифференциации, что происходит в несколько этапов в семенных канальцах яичек 1. Вкратце, стволовых как сперматогоний, что проживание вблизи эпителия семенных канальцев разделяй и дифференцироваться в сперматоцитах, которые затем подвергаются мейоза дивизий. После мейоза завершена, в результате гаплоидные клетки, или круглые сперматиды, пройти спермиогенеза, процесс дифференциации, которая включает пролитие цитоплазме и уплотнения ядра. Сперматид постепенно развивать жгутик и пройти удлинение и конденсацию ядра, производя удлинения, а затем конденсационных сперматиды соответственно. Конечные продукты являются сперматозоиды, которые выделяются в просвет семенных канальцев и в конечном счете в придатке яичка, где они созревают дальше.
Поскольку процесс сперматогенеза полагается на специальных гормональных и молекулярных условий вяички, надежная система культуры в пробирке в течение всего процесса сперматогенеза до сих пор не разработана 2,3. Культура методы были разработаны для создания "ячейки-подобные клетки примордиальных зародышевых" и гаплоидных, "круглые сперматид-подобные клетки" из стволовых клеток, но эти методы еще не в состоянии генерировать большое количество этих клеток и не дают позже сперматогенеза ячейку типы 4,5. К счастью, сперматогенного типы клеток существенно отличаются по размеру, что позволяет суспензии одноклеточных, полученной из цельного яичек быть разделены с жидким градиента. Метод СТА-PUT, продемонстрировали здесь, использует линейный градиент BSA и простой осаждение отделить сперматогенного клетки в зависимости от размера и массы 6-9.
Метод СТА-PUT имеет ряд преимуществ перед другими двумя наиболее широко используемых методов для отделения сперматогенного типов клеток: FACS и отмучивание 10-13. СТА-PUT аппарат требует ОНЛу несколько частей специализированной посуды собраны в холодном помещении или большой холодильник. Таким образом, это дешевле, чем с использованием клеточного сортера или элюент. Способ STA-PUT дает более высокое количество клеток каждого типа клеток и семенниках, чем могут быть отсортированы по FACS в сопоставимой времени, хотя чистота каждой клеточной популяции не так высока, как полученные с FACS 11. Сотовый сортировки с использованием магнитных шариков (магнитный Активированный сортировки клеток, MACS) недавно был успешно применен для обогащения сперматогониев из смешанного яичек клеточной популяции, в настоящий момент неподходящим для разделения сперматоциты или сперматиды из-за незнания соответствующей поверхностных маркеров 14. Дополнительным преимуществом способа STA-PUT над FACS или MACS является возможность изолировать жизнеспособных клеток, подходящих для последующей культуры, потому что, в отличие от большинства протоколов FACS, он не требует никакого ДНК или другие типы окрашивания. Для исследований, требующих лArge выходы сперматогенных типов клеток при ~ 90%-ной чистоты, СТА-PUT является идеальным методом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Те, кто изучает сперматогенез полагаться на животных моделях для образцов сперматогенных клеток, как надежная система культуры клеток еще не существует для генерации всех типов сперматогенного клеток 3. Хотя сперматогенного клетки легко собраны из цельных яичек, приводит тольк?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано NIH гранты GM055360 к SLB и U54HD068157 к агр. JMB была поддержана T32 генетики подготовки Грант в Университете Пенсильвании (GM008216).
Materials
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher | ||
Riferimenti
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
- Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
- Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
- Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
- Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
- Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
- Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
