Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation
Summary
Procédé STA-PUT permet la séparation des différentes populations de cellules spermatiques fonction de la taille et de la densité.
Abstract
Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules. Actuellement, il n'existe pas de système de culture cellulaire fiable permettant la différenciation de la spermatogenèse in vitro, et la plupart des études biologiques des cellules spermatiques nécessite récolte des tissus de modèles animaux comme la souris et le rat. Parce que le testicule contient de nombreux types cellulaires – à la fois non-spermatogenèse (Leydig, de Sertoli, myéloïdes et les cellules épithéliales) et la spermatogenèse (spermatogonies, spermatocytes, spermatides rondes, condensation spermatides et spermatozoïdes) – études des mécanismes biologiques impliqués dans la spermatogenèse nécessiter l'isolement et l'enrichissement de ces différents types cellulaires. Procédé STA-PUT permet la séparation d'une population hétérogène de cellules – dans ce cas, des testicules – à travers un gradient linéaire de BSA. Types cellulaires individuels sédimentent avec la vitesse de sédimentation différente selon CEtaille de ll, et les fractions enrichies en différents types de cellules peuvent être recueillies et utilisées dans d'autres analyses. Bien que la méthode STA-PUT n'entraîne pas de fractions très pures de types de cellules, par exemple comme on peut obtenir avec certaines méthodes de tri cellulaire, il ne fournit avec un rendement beaucoup plus élevé de cellules totales dans chaque fraction
(~ 1 x 10 8 cellules / spermatogenèse type à partir d'une population de départ de 08.07 x 10 8 cellules de la cellule). Cette méthode à haut rendement nécessite que la verrerie spécialisée et peut être effectuée dans n'importe quelle pièce froide ou grand réfrigérateur, ce qui en fait une méthode idéale pour les laboratoires qui ont un accès limité à de l'équipement spécialisé comme un trieur activé par fluorescence de cellules (FACS) ou élutriateur.
Introduction
Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules 1. En bref, la tige-comme spermatogonies qui résident près de l'épithélium du tubule séminifère fracture et se différencient en spermatocytes, qui subissent alors des divisions méiotiques. Après la méiose est terminée, les cellules haploïdes résultant, ou spermatides rondes, subissent la spermiogenèse, un processus de différenciation qui implique l'effusion du cytoplasme et le compactage du noyau. Spermatides développent progressivement un flagelle et subissent un allongement et la condensation du noyau, la production d'allongement puis condensation spermatides, respectivement. Les produits finaux sont les spermatozoïdes, qui sont libérés dans la lumière du tube séminifère et finalement dans l'épididyme, où ils mûrissent plus loin.
Parce que le processus de la spermatogenèse dépend des conditions hormonaux et moléculaires spéciauxles testicules, un système fiable de culture in vitro pour l'ensemble du processus de la spermatogenèse n'a pas encore été mis au point 2,3. Les méthodes de culture ont été développés pour créer des "cellules analogues à des cellules germinales primordiales» et «cellules rondes de spermatides comme" haploïdes à partir de cellules souches, mais ces méthodes ne sont pas encore en mesure de générer un grand nombre de ces cellules et ne parviennent pas à produire cellule spermatogenèse plus tard types de 4,5. Heureusement, les types de cellules spermatiques diffèrent de manière significative dans la taille, ce qui permet une suspension à cellule unique obtenue à partir de testicules entiers à séparer avec un gradient liquide. La méthode STA-PUT, démontré ici, utilise un gradient linéaire BSA et simple sédimentation pour séparer les cellules spermatiques fonction de la taille et de la masse 6-9.
La méthode STA-PUT a plusieurs avantages par rapport aux deux autres méthodes les plus utilisées pour séparer les types de cellules spermatiques: FACS et élutriation 10-13. L'appareil STA-PUT nécessite ONLy plusieurs pièces de verrerie spécialisé assemblés dans une chambre froide ou un grand réfrigérateur. Ainsi, il est moins coûteux que d'utiliser un trieur de cellules ou un séparateur par décantation. La méthode STA-PUT produit des quantités plus élevées de cellules par type de cellule et les testicules que peuvent être triés par FACS dans un laps de temps comparable, bien que la pureté de chaque population de cellules n'est pas aussi élevés que ceux obtenus avec FACS 11. Tri cellulaire utilisant des billes magnétiques (magnétique tri cellulaire activé, MACS) a récemment été utilisée avec succès pour l'enrichissement de spermatogonies à partir d'une population de cellules testiculaires mixte, mais il est actuellement inadapté pour séparer spermatocytes ou spermatides en raison du manque de connaissances de surface appropriée les marqueurs 14. Un avantage supplémentaire de la méthode STA-PUT sur FACS ou MACS est la capacité à isoler des cellules viables aptes à la culture ultérieure parce que, contrairement à la plupart des protocoles de FACS, il ne nécessite pas d'ADN ou d'autres types de coloration. Pour des études nécessitant lrendements arge de la spermatogenèse types de cellules à ~ 90% de pureté, le STA-PUT est une méthode idéale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ceux qui étudient la spermatogenèse s'appuient sur des modèles animaux pour des échantillons de cellules spermatiques, comme il n'existe pas encore un système de culture cellulaire fiable pour générer tous les types cellulaires de la spermatogenèse 3. Bien que les cellules spermatiques sont facilement collectées à partir des testicules entiers, seule une population mixte résulte. Cela pose un problème pour ceux qui souhaitent étudier les sous-types spécifiques de ces cellules, comm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le NIH subventions GM055360 de SLB et U54HD068157 de RGM. JMB a été pris en charge par la subvention de formation T32 génétique à l'Université de Pennsylvanie (GM008216).
Materials
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher | ||
Riferimenti
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