Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation
Summary
Die STA-PUT Verfahren ermöglicht die Trennung der verschiedenen Populationen von Zellen spermatogenic basierend auf Größe und Dichte.
Abstract
Säugetier Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, der Differenzierung in den Samenkanälchen der Hoden in mehreren Stufen erfolgt. Derzeit gibt es keine zuverlässigen Zellkultursystem, das für die Spermatogenese in vitro Differenzierung, und die meisten biologischen Untersuchungen der Spermatogenese Zellen benötigen Ernte Gewebe aus Tiermodellen, wie Maus und Ratte. Da die Hoden enthält zahlreiche Zelltypen – sowohl nicht-Spermatogenese (Leydig, Sertoli, myeloische und Epithelzellen) und Spermatogenese (Spermatogonien, Spermatozyten, runde Spermatiden, Brenn Spermatiden und Spermatozoen) – Studien über die biologischen Mechanismen der Spermatogenese beteiligt erfordern die Isolation und Anreicherung dieser verschiedenen Zelltypen. Die STA-PUT Verfahren ermöglicht die Trennung einer heterogenen Population von Zellen – in diesem Fall aus den Hoden – durch einen linearen Gradienten BSA. Einzelne Zelltypen mit unterschiedlichen sedimentieren Sedimentationsgeschwindigkeit nach cell Größe und Fraktionen für verschiedene Zelltypen angereichert können gesammelt und in weitere Analysen genutzt werden. Während der STA-PUT Verfahren nicht in hochreiner Fraktionen von Zelltypen, wie z. B. mit bestimmten Zellsortierverfahren erreicht werden ergeben, liefert es eine wesentlich höhere Ausbeute an Gesamtzellen in jeder Fraktion
(~ 1 × 10 8 Zellen / Spermatogenese Zelltyp aus einer Anfangspopulation von 7-8 x 10 8 Zellen). Diese hohe Ausbeute Methode erfordert nur Glaswaren spezialisiert und kann in jeder kalten Raum oder großer Kühlschrank durchgeführt werden, so dass es eine ideale Methode für Labors, die nur begrenzten Zugang zu spezialisierten Geräten wie einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) oder Elutriator haben.
Introduction
Säugetier Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, der Differenzierung in den Samenkanälchen der Hoden ein in mehreren Stufen erfolgt. Kurz gesagt, wie Stammzellen-Spermatogonien, die in der Nähe des Epithels der Samenkanälchen Kluft wohnen und differenzieren sich in Spermatozyten, die dann meiotischen Teilungen zu unterziehen. Nach Abschluss der Meiose ist die resultierenden haploiden Zellen oder runden Spermatiden, Spermiogenese unterziehen, eine Differenzierung, die den Abbau von Zytoplasma und Verdichtung der Kern beinhaltet. Spermatiden schrittweise ein Flagellum und Dehnung und Kondensation des Kerns unterzogen, wodurch verlängert und dann Kondensieren Spermatiden sind. Die Endprodukte sind Spermatozoen, die in das Lumen des Tubulus und schließlich in den Nebenhoden, wo sie weiter reifen freigesetzt.
Da der Prozess der Spermatogenese sieht spezielle hormonelle und Molekularbedingungendie Hoden, eine zuverlässige in vitro-Kultursystem für den gesamten Prozess der Spermatogenese wurde noch nicht entwickelt worden ist 2,3. Kultur Methoden für die Erstellung von "Ur-Keimzellen-ähnlichen Zellen" und haploid, "rund Spermatide-ähnliche Zellen" aus Stammzellen entwickelt worden, aber diese Methoden sind noch nicht in der Lage, eine große Anzahl dieser Zellen zu erzeugen und nicht zu später spermatogenen Zelle erzeugen 4,5 Typen. Glücklicherweise unterscheiden sich die Spermatogenese Zelltypen deutlich in der Größe, die für eine aus ganzen Hoden mit einer Flüssigkeit Gradienten getrennt werden, erhalten Einzelzellsuspension ermöglicht. Die STA-PUT-Methode, hier gezeigt, verwendet einen linearen Gradienten BSA und einfache Sedimentation spermatogenen Zellen zu trennen, basierend auf Größe und Masse 9.6.
Die STA-PUT-Methode hat mehrere Vorteile gegenüber den anderen beiden am häufigsten verwendeten Methoden, um spermatogenen Zelltypen zu trennen: FACS und Elutriation 10-13. Die STA-PUT Gerät erfordert only mehrere Stücke von Glaswaren spezialisiert in einem kalten Raum oder großer Kühlschrank montiert. Somit ist es weniger teuer als die Verwendung eines Zellsortierer oder eine Elutriator. Die STA-PUT Verfahren ergibt höhere Mengen an Zellen pro Zelltyp und Testis, als durch FACS in einer vergleichbaren Zeitspanne sortiert werden, wobei die Reinheit jeder Zellpopulation ist nicht so hoch wie die mit FACS-11 erhalten. Zellsortierung Verwendung magnetische Kügelchen (magnetisch aktivierten Zellsortierung, MACS) wurde kürzlich erfolgreich für die Anreicherung von Spermatogonien aus einer gemischten Zellpopulation Hoden beschäftigt, aber es ist derzeit für die Trennung Spermatozyten oder Spermatiden aufgrund mangelnder Kenntnisse der entsprechenden Oberfläche Marker 14 ungeeignet ist. Ein zusätzlicher Vorteil der STA-PUT Verfahren über FACS oder MACS ist die Fähigkeit, lebensfähige Zellen für die nachfolgende Kultur zu isolieren, weil im Gegensatz zu den meisten FACS Protokolle sie keine DNA oder andere Arten der Färbung erforderlich. Für Studien, die l erfordernarge Ausbeuten der Spermatogenese Zelltypen bei ~ 90% Reinheit, ist der STA-PUT eine ideale Methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diejenigen, die Spermatogenese studieren verlassen sich auf Tiermodelle für die Spermatogenese Zellproben, wie eine zuverlässige Zellkultursystem noch nicht zur Erzeugung spermatogenen alle Zelltypen 3 existieren. Obwohl spermatogenen Zellen leicht aus ganzen Hoden gesammelt, führt nur eine gemischte Bevölkerung. Dies stellt ein Problem für diejenigen, die auf bestimmte Subtypen dieser Zellen, wie meiotischen Zellen, runden Spermatiden, und Kondensations Spermatiden studieren möchten. Drei verschiedene …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse GM055360 zu SLB und U54HD068157 zu RGM unterstützt. JMB wurde von der T32 Genetik Ausbildungsförderung an der Universität von Pennsylvania (GM008216) unterstützt.
Materials
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher | ||
Riferimenti
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