顺行运输Alphaherpes病毒传播的活细胞成像
Summary
活细胞成像的alphaherpes病毒感染使动态的定向运输和细胞间传播的事件分析。在这里，我们提出的方法，利用重组病毒株表达荧光融合蛋白，以方便在感染病毒组件可视化的初级神经元。
Abstract
活细胞荧光显微技术，以及建设反映荧光融合蛋白的重组病毒株的进展已使能运输和扩散的alphaherpes病毒感染的神经元的实时可视化。本实用新型荧光融合蛋白病毒膜，皮层和衣壳，结合活细胞成像，确定病毒颗粒组件轴突内进行运输。类似的工具已经成功地采用了细胞 – 细胞间传播的病毒颗粒定量细胞间传送的病毒粒子的数量和多样性分析。更重要的是，顺行运输和传播的活细胞成像技术产生财富包括粒子输运速度，颗粒的分布，时间和分析蛋白质的本地化的信息。除了经典的病毒的基因技术，这些方法提供了重要的见解进入重要的机械问题。在这篇文章中，我们详细描述的成像方法，回答基本问题的alphaherpes病毒运输和蔓延。
Introduction
外周神经系统（PNS）alphaherpes病毒如单纯疱疹病毒（HSV）-1，-2，伪狂犬病病毒（PRV）感染涉及到一些复杂和高度调节的步骤，整个病毒的生命周期。 PNS的神经元内的交通运输是至关重要的两个主要病毒感染和后续主机间传播的事件期间。调节的分子机制，病毒的生命周期的两个组成部分;定向运输的轴突（顺运输）和后续传输的病毒粒子易感细胞（顺价差）从细胞组织内的病毒组件是重要的是要了解疱疹的发病机制。
病毒颗粒神经元的运输和出口的依赖于一个成熟的传染性病毒粒子1,2组装。此前固定的检测，包括免疫荧光（IF）和电子显微镜（EM），分别用于研究粒子组装状态和PROT运输和传播的病毒粒子3-6艾因相互作用。然而，运送病毒颗粒和实验文物化学固定推出的动态性质混淆固定图像7,8的解释。最近，已经描述了一些病毒荧光融合蛋白，单纯疱疹病毒，伪狂犬病毒，可以忽略不计的蛋白质的功能上的影响。绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（mCherry或MRFP）的荧光基团往往是成对两个成熟的病毒粒子的衣壳，表膜，和糖蛋白9-11的三个结构部件，以允许成像。活细胞成像的顺交通使用双标记病毒的病毒颗粒的装配状态可视化，在运输过程中。类似的荧光基团，表示病毒株用于可视化传播12,13后的病毒基因组的数目和多样性。荧光蛋白的属性，（评论于14,15）极大地影响病毒或细胞的组件可视化的能力。时，应考虑的内在特性，荧光蛋白，包括自我相互作用和稳定性，设计和测试新的蛋白质融合的野生型功能的保存。
结合荧光蛋白融合，两个特征在体外细胞培养系统的就业和条块分割疱疹病毒感染活细胞成像：游离16 17（ 图1A）大鼠颈上神经节（SCG）神经元。在这两种系统中，胚胎SCG的解剖，解离为单细胞体，并在体外培养18镀。 SCG神经是植物神经系统的一部分，并可以很容易地通过神经生长因子（NGF）成为一个成熟的偏振态体外培养及诱导分化。游离SCG神经元的轴突形成扩展网络，使f或可视化的病毒颗粒，因为它们经过顺行运输6。条块分割的的SCG文化提供流体隔离神经细胞体（S舱）和远端轴突末端（N舱）19。先前已经公布的一些条块分割的神经元，使用原来的20改性Campenot室17的建设和使用的详细协议。允许选择性地感染神经元细胞体和子代病毒检测后交通隔离轴突末端流体隔离。电镀上皮细胞感染前末端提供了受体细胞病毒感染的传播。
有多种人体必需的元素，重要的是所有活细胞成像实验，但最相关的我们的协议是：自动化图像采集，荧光灯照明系统，成像速度和环境控制。对于所有成像实验中，我们使用一个倒置的，自动化的，落射荧光照明显微镜（ 图1B）。该显微镜是围绕尼康Eclipse钛基地迅速重新配置在自动显微镜图像采集，并采用了微机控制的电动系统。对于荧光照明，我们使用一种广谱汞弧灯，可以中性密度滤光片照明路径衰减。激发滤光片荧光灯照明系统的频谱限制，并搭配多通可视化特异性荧光化合物的分色镜和荧光发射滤波器。被安装在独立的，快速的切换滤光器轮的激发和发射滤波器，使不同的荧光通道的快速顺序采集。的图像采集速度得到进一步增强，有灵敏和快速的EM-CCD摄像头，用于检测低强度的信号和短的图像读取时间。环境控制上力显微镜OPE是实现与一个阶段顶部加热孵化器和物镜加热器，以保持饱和湿度和CO 2富集的气氛是通过在升高的温度下，同时放入培养箱样品。显微镜是保持在一个黑暗的房间里，环境温度保持接近25°C和外界光线，遮光窗帘上的所有窗口最小化。以下协议描述了使用该系统的顺运输和蔓延检测。
存在一些替代品来控制活细胞成像的变量。显微镜设置的控制可以通过手动进行，或者依赖于专有软件的自动化系统。荧光照明，可以实现用卤素，LED或激光源。修改成像的速度由速度的滤波器切换可视化成对的检测系统中的信号的时间。环境控制，可以实现与专用硬件英里croscope阶段，外壳加热和加湿的框中，然后在显微镜的全部或部分，或通过将执行显微镜的房间的升温。这些替代品中的每一个都涉及到成本和性能都有优点和缺点。
在随后的协议，我们详细使用活细胞成像研究通过使用重组病毒株的快速顺运输顺alphaherpes病毒蔓延。活细胞成像实时可视化衣壳，皮层和/或糖蛋白共定位11轴突内进行运输的动态结构。条块分割的神经文化隔夜慢速成像可视化轴突病毒粒子出口和感染易感细胞12。这里介绍的协议已经使用我们独特的成像系统进行了优化，但在广义上讲，相对于活细胞成像的四大要素。在我们的讨论将进一步详细一些优化成功的实验是必要的。
Protocol
Representative Results
Discussion
活细胞成像的目的是观察生物过程，因为他们没有发生显着改变的行为观察。实现此目标，通过优化三个变量：环境控制，成像速度和荧光照明。必须平衡这些相互依存的变量，以实现可行的成像条件。协议利用特定的条件下产生的有代表性的结果。我们将简要讨论环境控制和观测损坏，然后详细介绍了具体的方法。
在显微镜上建立和维护相关的生物条件下的细胞事件监测?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LWE和RK支持由美国国立卫生赠款R37 NS033506-16和R01 NS060699-03。 MPT支持美国癌症协会的博士后研究奖学金（PF-10-057-01-MPC）。马修·莱曼博士和奥伦Kobiler博士的咨询和知识的的显微镜配置和活细胞成像方法设计。我们也感谢尼尔·巴洛和Brian T.凯因尼康仪器的购置，安装和性能的显微镜技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
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