De células vivas de Alphaherpes Vírus Transporte anterógrada e Spread
Summary
Imagem de infecções por vírus alphaherpes células vivas permite a análise dos eventos dinâmicos de transporte e dirigido propagação intercelular. Apresentamos aqui as metodologias que utilizam estirpes de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão fluorescentes para facilitar a visualização dos conjuntos virais durante a infecção de neurónios primários.
Abstract
Os avanços nas técnicas de microscopia de fluorescência de células vivas, bem como a construção de estirpes de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão fluorescentes permitiram a visualização em tempo real de transporte e de propagação da infecção pelo vírus da alphaherpes de neurónios. A utilidade de novas proteínas de fusão fluorescentes a membrana viral, tegumento, cãpsides e, em conjunto com a imagem de células vivas, identificados conjuntos de partículas virais submetidos transporte dentro axónios. Ferramentas similares têm sido empregados com sucesso para a análise de célula-célula espalhados de partículas virais para quantificar o número ea diversidade de virions transmitidos entre as células. É importante ressaltar que as técnicas de imagens de células vivas de transporte anterógrado e propagação produzir uma riqueza de informações, incluindo velocidades de partículas de transporte, distribuição de partículas e análises temporais de localização de proteínas. Ao lado de técnicas genéticas virais clássicos, estas metodologias têm proporcionado uma visão críticaem questões importantes mecanicistas. Neste artigo vamos descrever em detalhes os métodos de imagem que foram desenvolvidos para responder a perguntas básicas de transporte de vírus alphaherpes e se espalhar.
Introduction
A infecção do sistema nervoso periférico (SNP) por alphaherpes vírus tais como o vírus herpes simplex (HSV) -1, -2, e vírus da pseudo-raiva (PRV), envolve vários passos intrincados e altamente regulada durante o ciclo de vida viral. Transporte no interior dos neurônios PNS é fundamental durante os eventos de ambas infecção viral primária e posterior disseminação inter-host. Os mecanismos moleculares que modulam dois componentes do ciclo de vida viral, transporte dirigido de conjuntos virais longe de corpos celulares dentro dos axônios (transporte anterógrado) e subsequente transmissão de partículas virais em células suscetíveis (propagação anterógrada) são importantes para a compreensão herpesvírus patogênese.
O transporte e saída de partículas virais nos neurônios depende de montagem de um maduro 1,2 virion infeccioso. Ensaios anteriormente fixos, incluindo imunofluorescência (IF) e microscopia eletrônica (ME), foram usados para estudar o estado de montagem da partícula e protinterações ein associados ao transporte virion e propagação 3-6. No entanto, a natureza dinâmica do transporte de partículas virais e artefatos experimentais introduzidas pela fixação química confundiu a interpretação de imagens fixas 7,8. Recentemente, uma série de proteínas de fusão vírica fluorescentes têm sido descritos para o HSV e PRV, que tem impactos insignificantes sobre a função da proteína. Proteína Fluorescente Verde (GFP) e proteínas fluorescentes vermelhas (mCherry ou MRFP) fluoróforos são muitas vezes combinadas para permitir imagiologia de dois dos três componentes estruturais de um virião maduro: cápside, tegumento e glicoproteína 9-11. Ao vivo imagens de células de transporte anterógrado usando vírus de dupla-rotulados visualiza o estado de montagem de partículas virais durante o transporte. Fluoróforo similares expressando estirpes virais são utilizados para visualizar o número e diversidade de genomas virais seguintes propagação 12,13. As propriedades das proteínas fluorescentes (revisto em 14,15) ser de grande impactoa capacidade de visualizar conjuntos virais ou celulares. As propriedades intrínsecas da proteína fluorescente, incluindo a auto-interações e estabilidade, devem ser considerados ao projetar e testar novas fusões de proteínas para a preservação da funcionalidade do tipo selvagem.
Em conjugação com proteínas de fusão fluorescentes, dois bem caracterizadas em sistemas de cultura de células in vitro são utilizados para imagiologia de células vivas de infecção pelo vírus do herpes: dissociado 16 e compartimentada 17 (Figura 1A), os gânglios do rato (SCG) neurónios cervicais superiores. Em ambos os sistemas, embrionário do SCG são dissecados, dissociadas de corpos de células individuais, e banhado por cultivo in vitro 18. Neurónios SCG são parte do sistema nervoso autonômico e podem ser facilmente cultivadas e diferenciadas por factor de crescimento neuronal (NGF) para um estado maduro polarizada ex vivo. SCG neurônios dissociados formar uma extensa rede de axônios que permite que fou a visualização de partículas virais como se submetem anterógrada transporte 6. Culturas SCG compartimentadas fornecer isolamento de fluidos do corpo celular neuronal (compartimento S) e terminais dos axônios distais (compartimento N) 19. Um certo número de protocolos detalhados para a construção e a utilização de neurónios em compartimentos utilizando original é de 20 ou 17 modificado Campenot câmaras foram publicados previamente. Isolamento fluídico permite a infecção seletiva de corpos celulares neuronais e detecção do vírus da progênie após o transporte de terminais axônio isoladas. Cultivar células epiteliais ao longo dos terminais antes da infecção proporciona células receptoras para a propagação de uma infecção viral.
Há muitos elementos essenciais importantes para toda experimentação imagens de células vivas, mas o mais relevante para os nossos protocolos são: aquisição automatizada de imagem, iluminação fluorescente, a velocidade de processamento de imagens e controle ambiental. Para todos os experimentos com imagens, usamosinvertido, automatizado, iluminação microscópio de epifluorescência (Figura 1B). O microscópio é construído em torno da Nikon Eclipse Ti base e emprega um número de computadores sistemas motorizados controlados para reconfigurar rapidamente o microscópio durante a aquisição de imagem automatizado. Para a iluminação de fluorescência, usamos um amplo espectro da lâmpada de arco de mercúrio que podem ser atenuados com filtros de densidade neutra ao longo do percurso de iluminação. Filtros de excitação limitar o espectro de iluminação fluorescente e, quando combinados com espelhos dicróicos de multi-pass e filtros de emissão de fluorescência visualizar compostos fluorescentes específicos. Os filtros de excitação e de emissão são montados em rodas, rápido filtro de comutação independentes que permitam a aquisição sequencial rápida de canais diferentes fluorescentes. A velocidade de aquisição de imagem é reforçada com uma câmera EM-CCD sensível e rápido, útil para a detecção de sinais de baixa intensidade e curta imagem leia vezes. O controle ambiental no microscope é conseguido com uma fase superior aquecida incubadora e um aquecedor de lente objectiva para manter as amostras a temperaturas elevadas, enquanto a 2 atmosfera humidificada e enriquecida em CO é passada para dentro da incubadora. O microscópio é mantido em uma sala escura, com temperatura ambiente mantida próxima a 25 ° C e luz fora minimizado com cortinas blackout em todas as janelas. Os protocolos seguintes descrevem a utilização deste sistema para o transporte de forma anterógrada e ensaios de propagação.
Um certo número de alternativas existem para controlar as variáveis de imagem de células vivas. O controlo das definições de microscopia pode ser efectuada manualmente ou através de sistemas automatizados dependentes software proprietário. Fluorescência de iluminação pode ser conseguida com halogéneo, as fontes de laser ou diodo emissor de luz. A velocidade de imagem é modificado a partir da velocidade de comutação do filtro e do tempo para visualizar o sinal com o sistema de detecção associado. Controlo ambiental pode ser alcançada com equipamento especializado na mifase croscope, cerco de todo ou parte do microscópio numa caixa aquecida e humidificada, ou por elevação da temperatura da sala onde a microscopia será executada. Cada uma dessas alternativas tem vantagens e desvantagens associadas ao custo e desempenho.
No protocolo subsequente, que detalhe a utilização de imagem de células vivas para estudar anterógrado rápido transporte e propagação anterógrada alphaherpes de vírus através da utilização de estirpes virais recombinantes. Imagens de células vivas em tempo real visualiza capsídeo, tegumento e / ou glicoproteína co-localização em estruturas dinâmicas submetidos transporte dentro dos axônios 11. Imagem timelapse durante a noite de culturas neuronais compartimentadas visualiza saída virion axonal e infecção de células susceptíveis 12. Os protocolos aqui apresentados foram otimizados para uso com nosso sistema de imagem particular, mas são apresentados em termos gerais relativas aos quatro elementos de imagens de células vivas. Na discussão queserá mais detalhadamente alguns dos otimização que é necessária para a experimentação bem sucedida.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo de imagens de células vivas é observar processos biológicos como eles ocorrem sem alteração significativa pelo ato de observação. Este objetivo é alcançado por meio da otimização de três variáveis: o controle ambiental, a velocidade de processamento de imagens e iluminação de fluorescência. Estas variáveis inter-dependentes deve ser equilibrada para alcançar condições de imagem viáveis. Os protocolos apresentados utilizam condições específicas para produzir os resultados represen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LWE e RK são suportados pelo National Institutes of Health bolsas R37 NS033506-16 e R01 NS060699-03 dos EUA. MPT foi apoiado por uma Sociedade Bolsa de Investigação Pós-Americana de Câncer (PF-10-057-01-MPC). Os conselhos e conhecimento do Dr. Matthew Lyman e Dr. Oren Kobiler foram fundamentais para projetar a configuração do microscópio e métodos de imagem de células vivas. Também agradecer a Neal Barlow e Brian T. Kain da Nikon Instruments para sua assistência técnica na aquisição, instalação e performance do microscópio.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
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