Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング
Summary
alphaherpesウイルス感染のライブセルイメージングに向け輸送と細胞間スプレッドの動的事象の分析を可能にします。ここでは、一次ニューロンのウイルス感染中にアセンブリの可視化を容易にするために、蛍光融合タンパク質を発現する組換えウイルス株を利用する手法を提案する。
Abstract
生細胞の蛍光顕微鏡技術と同様に、蛍光融合タンパク質を発現する組換えウイルス株の構築の進歩は、輸送およびニューロンのalphaherpesウイルス感染の広がりのリアルタイム可視化を有効にしている。ライブセルイメージングと一緒にウイルス膜、被包、およびキャプシドに新規蛍光融合タンパク質の有用性は、軸索内輸送を受けてウイルス粒子アセンブリを同定した。同様のツールが正常細胞との間で送信さビリオンの数と多様性を定量化するウイルス粒子の広がり細胞 – 細胞の分析に用いられてきた。重要なのは、順行性輸送と普及のライブセルイメージングの技術は、粒子輸送速度、粒子の分布、およびタンパク質の局在の時間的分析を含む豊富な情報を生成します。古典的なウイルスの遺伝子技術と並んで、これらの方法論は、重要な洞察を提供してきた重要な機械論的な質問へ。この記事では、詳細にalphaherpesウイルス輸送と広がりの基本的な質問に答えるために開発された撮像法について説明します。
Introduction
alphaherpesなどの単純ヘルペスウイルスなどのウイルス（HSV）-1、-2、および仮性狂犬病ウイルスによる末梢神経系（PNS）の感染（PRV）ウイルスのライフサイクル全体を通じて、いくつかの複雑かつ高度に規制の手順が必要。 PNSの神経細胞内の輸送は、プライマリウイルス感染とその後のホスト間の広がりの両方のイベント中に、非常に重要です。ウイルスのライフサイクルの二つの成分を調節する分子機構、感受性細胞へ離れて軸索内の細胞体（順行性輸送）からのウイルスアセンブリの監督輸送とビリオンのその後の送信（順行スプレッド）はヘルペスウイルスの病因を理解する上で重要です。
神経細胞におけるウイルス粒子の輸送と出口は、成熟感染性ビリオン1,2のアセンブリに依存しています。免疫蛍光法（IF）および電子顕微鏡（EM）を含む予め固定されたアッセイは、粒子の組立て状態とprotのを研究するために使用されたビリオン輸送と広がり3-6関連付けられたEINの相互作用。しかし輸送ビリオンおよび化学固定によって導入された実験的な成果物の動的な性質は、固定された画像7,8の解釈を混同。最近、ウイルスの蛍光融合タンパク質の数は、タンパク質の機能にほとんど影響を与えるHSVおよびPRVについて記載されている。キャプシド、被包、および糖タンパク質9-11：緑色蛍光タンパク質（GFP）及びレッド蛍光タンパク質（mCherryまたはmRFPを）フルオロフォアは、しばしば、成熟ビリオンの3つの構造構成要素のうちの2つの撮像を可能にするように対になっている。二重標識ウイルスを用いた順行性輸送の生細胞イメージングは輸送中のウイルス粒子の組立て状態を可視化する。ウイルス株を発現する同様の蛍光体は、数および拡散12,13に続くウイルスゲノムの多様性を可視化するために使用される。蛍光タンパク質の特性は（14,15で検討）が大きく影響しウイルスまたは細胞のアセンブリを視覚化する能力。野生型の機能性の保全のための新規なタンパク質融合を設計し、テストするときに、自己相互作用と安定性を含む蛍光タンパク質、、の本質的な特性を考慮する必要があります。
蛍光タンパク質融合と組み合わせて、二人はインビトロでの細胞培養系において十分に特徴付けヘルペスウイルス感染の生細胞のイメージングのために使用される（ 図1A）16解離し、17区画ラット上頸神経節（SCG）ニューロン。両方のシステムでは、胚のSCGのは、単一の細胞体への解離、解剖され、in vitroで培養する18のためにメッキ。 SCGニューロンは、自律神経系の一部であり、容易に成熟した偏光状態を ex vivoで培養し、神経細胞への成長因子（NGF）によって区別することができる。解離SCGニューロンは、Fを可能に軸索の拡張されたネットワークを形成彼らは順行性輸送6を受けるようにウイルス粒子のか視覚化。区分SCG文化が神経細胞体（S区画）および遠位軸索末端（Nコンパートメント）19の流体分離を提供。原稿20又は変性Campenotチャンバ17を用いて区画ニューロンの構造及び使用のための詳細なプロトコルの数は、以前に公表されている。流体分離は、神経細胞体と孤立軸索末端への輸送後の子孫ビリオンの検出を選択的に感染することができます。感染前末端上の上皮細胞をメッキするとウイルス感染の広がりのためにレシピエント細胞を提供する。
そこにすべてのライブセルイメージング実験のための重要な多くの重要な要素がありますが、我々のプロトコルに最も関連性があります：自動画像取得、蛍光灯照明、画像処理の速度、および環境制御。すべてのイメージング実験のために、我々が使用する反転、自動化され、落射蛍光照明顕微鏡（ 図1B）。顕微鏡はニコンエクリプスTiの基盤を中心に構築され、急速に再構成する自動画像取得中に顕微鏡を、コンピュータ制御電動システムの数を採用しています。蛍光照明のために、我々は、照明経路に沿って中性密度フィルタを減衰させることができる広域スペクトル水銀アークランプを使用する。励起フィルタは、蛍光照明のスペクトルを制限し、マルチパスダイクロイックミラーと蛍光発光フィルター特定の蛍光化合物を可視化と組み合わせた場合。励起および発光フィルターが異なる蛍光チャネルの急速順次取得を可能にするために独立した、高速スイッチングフィルターホイールに取り付けられている。画像取得速度が低い強度信号と短い画像の検出のための読み取り時間を有用な、高感度かつ高速のEM-CCDカメラではさらに向上する。 microsc上の環境制御OPEをインキュベーター加熱ステージ上と加湿CO 2に富んだ雰囲気をインキュベーターに渡されながら高温で試料を保持する対物レンズヒーターで達成される。顕微鏡は近い25までのすべての窓に遮光カーテンで最小化℃、外光を維持し、周囲温度と暗い部屋に保管されています。以下のプロトコルでは、順行性輸送及び拡散アッセイのための本システムの使用を記載している。
選択肢の数は、ライブセルイメージングの変数をコントロールするために存在します。顕微鏡の制御設定は、手動またはプロプライエタリ·ソフトウェアに依存して自動化システムを介して行うことができる。蛍光照明は、ハロゲン、LEDまたはレーザーソースで実現することができる。イメージング速度は、フィルタ切り替えの速度および一対の検出系と信号を可視化する時間によって修正される。環境制御は、マイルに専用のハードウェアで実現することができますcroscopeステージ全部または加熱および加湿ボックスで顕微鏡の一部、または顕微鏡検査が実行される部屋の温度を上げることによってのエンクロージャ。これらの選択肢の各々は、コストおよびパフォーマンスに関連する利点と欠点を有する。
その後のプロトコルでは、我々は詳細換えウイルス株を使用することにより迅速な順行性輸送とalphaherpesウイルスの順行広がりを研究するライブセルイメージングを使用すること。リアルタイムのライブセルイメージングは軸索11内輸送を受けて動的構造体上のカプシド、被包、および/ または糖タンパク質の共局在を可視化する。区分ニューロン培養の一夜タイムラプスイメージングは、感受性細胞の軸索のビリオン出口と感染12を可視化する。ここで提示プロトコルは、我々の特定のイメージング·システムと共に使用するために最適化されているが、生細胞のイメージングの四つの要素に対して大まかに示されている。議論では、私たち更に詳細は成功実験のために必要である最適化のいくつかの意志。
Protocol
Representative Results
Discussion
彼らは観察の行為によって重大な変更を加えること無く発生したライブセルイメージングの目的は、生物学的プロセスを観察している。環境制御、撮像速度、および蛍光照明：この目的は、3つの変数を最適化することによって達成される。これらの相互依存変数が実行可能な撮影条件を達成するためにバランスをとらなければなりません。提示プロトコルは、代表的な結果を生成するために…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LWEとRKは健康補助R37 NS033506-16とR01 NS060699-03の米国の国立研究所によってサポートされています。 MPTは、アメリカ癌協会ポスドク研究フェローシップ（PF-10から057-01-MPC）によってサポートされていました。博士マシュー·ライマン博士とオレンKobilerのアドバイスや知識は、顕微鏡の構成と生細胞イメージング法を設計に尽力しました。また、顕微鏡の取得、インストール、およびパフォーマンスの彼らの技術支援のためにニール·バーロウとニコンインスツルメンツ社のブライアン·T·ケインのおかげで拡張します。
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
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