Imaging cellulare dal vivo di Alphaherpes Virus Trasporti anterograda e Diffusione
Summary
L'imaging cellulare dal vivo di infezioni da virus alphaherpes consente l'analisi degli eventi dinamici di trasporto diretto e la diffusione intercellulare. Qui vi presentiamo le metodologie che utilizzano ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine di fusione fluorescenti per facilitare la visualizzazione delle assemblee virale durante l'infezione di neuroni primari.
Abstract
Progressi nelle tecniche di microscopia di fluorescenza di cellule vive, così come la costruzione di ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine di fusione fluorescenti hanno permesso visualizzazione in tempo reale di trasporto e diffusione del virus alphaherpes infezione di neuroni. L'utilità di nuove proteine di fusione fluorescenti a membrana virale, in involucri, e capsidi, in collaborazione con l'imaging cellulare dal vivo, identificato assemblee di particelle virali in fase di trasporto all'interno di assoni. Utensili simili sono stati impiegati con successo per analisi di cellula-cellula diffusione di particelle virali per quantificare il numero e la diversità di virioni trasmessi tra le cellule. È importante sottolineare che le tecniche di imaging cellulare dal vivo di trasporto anterogrado e la diffusione producono una ricchezza di informazioni tra le velocità delle particelle di trasporto, distribuzioni di particelle, e le analisi temporali della localizzazione delle proteine. Accanto a classici tecniche genetiche virali, queste metodologie hanno fornito spunti criticiin importanti questioni meccanicistici. In questo articolo descriviamo in dettaglio i metodi di imaging che sono stati sviluppati per rispondere alle domande fondamentali della alphaherpes trasporto e diffusione del virus.
Introduction
L'infezione del sistema nervoso periferico (SNP) di alphaherpes virus come il virus herpes simplex (HSV) -1, -2, e virus pseudorabies (PRV) prevede diversi passaggi intricati e altamente regolamentato in tutto il ciclo vitale del virus. Trasporto all'interno neuroni del sistema nervoso periferico è fondamentale durante gli eventi di entrambi infezione virale primaria e la successiva diffusione inter-host. I meccanismi molecolari che modulano due componenti del ciclo di vita virale; trasporto diretto delle assemblee virali di distanza dal corpo cellulare all'interno di assoni (trasporto anterogrado) e la successiva trasmissione dei virioni di cellule sensibili (diffusione anterograda) sono importanti per la comprensione herpesvirus patogenesi.
Il trasporto e l'uscita di particelle virali in neuroni dipende montaggio di un virione maturo infettiva 1,2. Saggi precedentemente fissato, tra l'immunofluorescenza (IF) e la microscopia elettronica (EM), sono stati usati per studiare lo stato di assemblaggio delle particelle e la protinterazioni ein connessi ai trasporti virione e la diffusione 3-6. Tuttavia la natura dinamica del trasporto di virioni e manufatti sperimentali introdotte dalla fissazione chimica confusa l'interpretazione delle immagini fisse 7,8. Recentemente, un certo numero di proteine di fusione virale-fluorescenti sono state descritte per HSV e PRV cui impatti trascurabili sulla funzionalità delle proteine. Proteina fluorescente verde (GFP) e proteine fluorescenti rossi (mCherry o MRFP) fluorofori sono spesso in coppia per consentire l'imaging di due dei tre componenti strutturali di un virione maturo: capside, tegumento, e glicoproteina 9-11. Imaging cellulare dal vivo di trasporto anterogrado utilizzando virus dual-etichettati visualizza lo stato di assemblaggio delle particelle virali durante il trasporto. Fluoroforo simili esprimendo ceppi virali vengono utilizzati per visualizzare il numero e la diversità dei genomi virali a seguito diffusione 12,13. Le proprietà delle proteine fluorescenti (recensione in 14,15) di grande impattola capacità di visualizzare assemblee virali o cellulari. Le proprietà intrinseche della proteina fluorescente, tra cui auto-interazione e di stabilità, devono essere considerati durante la progettazione e la sperimentazione di nuovi fusioni proteiche per la conservazione della funzionalità di tipo selvaggio.
In concomitanza con la fusione di proteine fluorescenti, due ben caratterizzati di sistemi di colture cellulari in vitro sono impiegate per l'imaging cellulare dal vivo di infezione da herpes virus: dissociata 16 e 17 compartimenti stagni (Figura 1A) ratto superiori gangli (SCG) neuroni cervicali. In entrambi i sistemi, embrione del SCG sono sezionati, dissociato da corpi cellulari singoli, e cromato per la coltura in vitro 18. Neuroni SCG sono parte del sistema nervoso autonomo e possono essere facilmente coltivate e differenziati per il fattore di crescita neuronale (NGF) in un maturo polarizzato stato ex vivo. Neuroni SCG dissociate formano una rete estesa di assoni che permette fo la visualizzazione di particelle virali in quanto sottoposti trasporto anterogrado 6. Culture SCG compartimenti stagni forniscono isolamento fluidico del corpo cellulare dei neuroni (vano S) e termini assoni distali (vano N) 19. Un certo numero di protocolli dettagliati per la costruzione e l'uso di neuroni compartimenti utilizzando originale 20 o modificati Campenot camere di 17 sono stati pubblicati in precedenza. Isolamento fluidico permette di infezione selettiva dei corpi cellulari neuronali e l'individuazione di virioni progenie dopo il trasporto a isolate Termini assoni. Placcatura cellule epiteliali nei termini prima dell'infezione fornisce cellule riceventi per la diffusione dell'infezione virale.
Ci sono molti elementi essenziali importanti per tutti gli esperimenti di imaging cellulare dal vivo, ma la più rilevante per i nostri protocolli sono: acquisizione automatica immagine, illuminazione fluorescente, velocità di formazione immagine e di controllo ambientale. Per tutti gli esperimenti di imaging, utilizziamorovesciata, automatizzato, microscopio a epifluorescenza illuminazione (Figura 1B). Il microscopio è costruito attorno al Nikon Eclipse Ti base e si avvale di un certo numero di sistemi motorizzati controllati da computer per riconfigurare rapidamente il microscopio durante l'acquisizione dell'immagine automatizzato. Per l'illuminazione a fluorescenza, usiamo un ampio spettro di mercurio lampada ad arco che può essere attenuato con filtri a densità neutra lungo il sentiero dell'illuminazione. Filtri di eccitazione limitano lo spettro di illuminazione fluorescente e quando accoppiato con multi-pass specchi dicroici e filtri di emissione di fluorescenza visualizzare i composti fluorescenti specifici. I filtri di eccitazione e di emissione sono montati, veloce commutazione ruote portafiltri indipendenti per consentire una rapida acquisizione sequenziale dei canali fluorescenti differenti. La velocità di acquisizione dell'immagine è ulteriormente rafforzata con una telecamera EM-CCD sensibile e veloce, utile per il rilevamento di segnali di bassa intensità e breve immagine tempi di lettura. Controllo ambientale sulla microscope è raggiunto con un alto stadio riscaldato incubatore e un riscaldatore lente obiettivo di mantenere i campioni a temperature elevate, mentre un umidificata e CO 2 atmosfera arricchita viene passato nell'incubatore. Il microscopio è tenuto in una stanza buia con temperatura ambiente mantenuto vicino ai 25 ° C e luce esterna minimizzato con tende oscuranti su tutte le finestre. I seguenti protocolli descrivono l'uso di questo sistema per il trasporto anterogrado e dosaggi diffusione.
Un certo numero di alternative esistono per il controllo per le variabili di imaging cellulare dal vivo. Il controllo delle impostazioni di microscopia può essere eseguita manualmente o tramite sistemi automatizzati dipendenti dal software proprietario. Illuminazione a fluorescenza può essere ottenuto con sorgenti laser alogeno, LED o. La velocità di formazione immagine viene modificata dalla velocità di commutazione filtro e il tempo di visualizzare il segnale con il sistema di rilevamento associato. Controllo ambientale può essere realizzato con hardware specializzato sul mifase croscope, recinto di tutto o parte del microscopio in una scatola riscaldata e umidificata, o elevando la temperatura della stanza in cui verrà eseguita microscopia. Ciascuna di queste alternative presenta vantaggi e svantaggi relativi a costi e prestazioni.
Nel protocollo successivo, abbiamo dettaglio l'uso di cellule vive per studiare rapido trasporto anterogrado e la diffusione di anterograda alphaherpes virus attraverso l'uso di ceppi virali ricombinanti. In tempo reale l'imaging cellulare dal vivo visualizza capside, tegumento, e / o della glicoproteina co-localizzazione su strutture dinamiche in fase di trasporto all'interno assoni 11. Pernottamento timelapse di imaging di colture neuronali compartimenti visualizza assonale uscita virione e l'infezione di cellule suscettibili 12. I protocolli presentati qui sono stati ottimizzati per l'uso con il nostro sistema di imaging particolare, ma sono presentati in termini generali relativi ai quattro elementi di imaging cellulare dal vivo. Nella discussione abbiamovolontà ulteriore dettaglio alcuni ottimizzazione che è necessario per la sperimentazione di successo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'obiettivo di imaging cellulare dal vivo sta osservando processi biologici che si verificano senza significative alterazioni con l'atto di osservazione. Questo obiettivo è raggiunto attraverso l'ottimizzazione tre variabili: il controllo ambientale, la velocità di formazione immagine, e l'illuminazione a fluorescenza. Queste variabili interdipendenti devono essere bilanciati per ottenere condizioni di imaging vitali. I protocolli presentati utilizzano specifiche condizioni per produrre i risultati rap…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LWE e RK sono supportati dal National Institutes of Health sovvenzioni R37 NS033506-16 e R01 NS060699-03. MPT è stato sostenuto da un Cancer Society Postdoctoral Fellowship americana Research (PF-10-057-01-MPC). La consulenza e la conoscenza del dottor Matteo Lyman e Dr. Oren Kobiler hanno contribuito a progettare la configurazione microscopio e metodi di imaging cellulare dal vivo. Abbiamo anche estendere grazie a Neal Barlow e Brian T. Kain di Nikon Instruments per la loro assistenza tecnica per l'acquisto, l'installazione e la performance del microscopio.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
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