Studerer Samhandling av<em> Staphylococcus aureus</em> Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Mikroskopi

Summary

Vi presenterer metoder for å studere effekten av PSMS og andre giftstoffer utskilt av<em> Staphylococcus aureus</em> På nøytrofile med flowcytometri og fluorescens mikroskopi.

Abstract

Vi presenterer metoder for å studere effekten av fenol oppløselige modulins (PSMS) og andre giftstoffer som produseres og utskilles av Staphylococcus aureus på neutrofiler. For å studere effektene av de PSMS på Neutrofilene Isoler ferske nøytrofiler ved hjelp av tetthetsgradient-sentrifugering. Disse nøytrofile er lastet med et fargestoff som fluoresces på kalsium mobilisering. Aktivering av nøytrofiler ved PSMS initierer en rask og forbigående økning i fritt intracellulært kalsium-konsentrasjon. I en flowcytometri eksperiment denne rask mobilisering kan måles ved å overvåke fluorescensen av et forhåndslastet fargestoff som reagerer på den økte konsentrasjonen av fri ^{Ca2 +.} Ved hjelp av denne metoden kan vi bestemme PSM konsentrasjonen som er nødvendig for å aktivere nøytrofile, og måle effekten av spesifikke og generelle hemmere av nøytrofile aktivering.

For å undersøke uttrykket av PSMS i den intracellulære plass, we har konstruert reporter fusjoner av arrangøren av den PSMα operon til GFP. Når disse reporter stammer av S. aureus er phagocytosed av nøytrofile, kan induksjon av uttrykket observeres med fluorescens mikroskopi.

Introduction

Nøytrofile (PMN) er profesjonelle fagocytter som spiller en nøkkelrolle i det medfødte immunforsvaret mot Staphylococcus aureus ^en. Den konstante kampen mellom vert og mikrobe har ført til et våpenkappløp av begge. Nylig, community-tilknyttede (CA) stammer av Meticillin resistente S. aureus (MRSA) har dukket opp som ser ut til å være svært effektiv i omgåelse av nøytrofile drapet ^2,3. Overdreven fenol løselig modulin (PSMS) produksjon av CA-MRSA har vært forbundet med høyere virulens ^4,5. Menneskelige nøytrofile kan gjenkjenne disse PSMS via FPR2 som fører til aktivering av denne G-protein koblet reseptor ^seks. En av de tidligste begivenheter er mobiliseringen av intracellulære lagre av kalsium ^{(Ca2 +).} Ca ^{2 +} fungerer som en sekundær budbringer for en rekke effektor funksjoner av PMN inkludert degranulering og fagocytose ^7.. Derfor Ca ^{2 +} er en svært følsom indikator påfunksjonell kapasitet på PSMS å aktivere PMN. Å studere effekter av PSMS på nøytrofile, er friske nøytrofile isolert og lastet med et fargestoff som fluoresces på kalsium mobilisering. I en flowcytometri eksperiment denne rask mobilisering kan måles. Ved hjelp av denne metode, er det mulig å studere de direkte effektene av giftige og andre komponenter på neutrofiler, og bestemme den laveste konsentrasjon ved hvilken disse er aktive. For oss er det et svært nyttig verktøy for å studere effekten av mange proteiner som produseres av S. aureus involvert i immune unndragelse, for eksempel FPR2 hemmende protein (FLIPR) ^8, FLIPR-aktig ^7, og Chemotaxis hemmende protein av Staphylococcus aureus (CHIPS) ^9. Alle disse proteiner har blitt vist å hemme kalsium-mobilisering i neutrofiler ved å binde til reseptoren gjenkjenne agonisten.

Nylig har vår gruppe beskrevet som PSMS er funksjonelt hemmet av serum lipoproteiner ^{10 <}/ Sup>. Disse lipoproteiner er rikelig tilstede i blod og vev fra mennesker, som indikerer at PSMS utøve sin funksjon i første rekke i den intracellulære miljøet. Tilgjengeligheten av kalsium-mobilisering analysen tillater oss å nøyaktig måle effekten av serum lipoproteiner på aktivering av nøytrofiler ved PSMS, angitt med betydelig hemning ved meget lave konsentrasjoner av serum.

Siden PSMS er funksjonelt inhiberes av serum, hypotese vi at det er en viktig funksjon for PSMS som intracellulære giftstoffer. Vi har derfor forsøkt å finne ut hvilken rolle PSMS etter fagocytose. For å undersøke uttrykket av PSMS i intracellulære plass, har vi bygget reporter fusjoner av arrangøren av den psmα operon til GFP. Når disse reporter stammer av S. aureus ble phagocytosed av nøytrofile ble induksjon av uttrykket observerbar med fluorescens mikroskopi ^10. Selvfølgelig, dette technique tillater undersøkelse av ekspresjonen av et stort antall gener i S. aureus eller andre patogener etter fagocytose. Siden for S. aureus overleve i det intracellulære nisje er svært viktig for å overvinne det medfødte immunsystemet ^{11 10 12,} studere rollen til gener aktiveres i denne nisjen er svært relevant for å forstå dens virulens.

Protocol

En. Isolering av PMN fra humant blod etter Tetthet Sentrifugering Tegn 5 9 ml rør av heparinisert venøs blod. Forbered tolags Ficoll gradienter (4 gradienter for 5 rør blod) som følger: Hell 12 ml av en densitet 1,119 g / ml Ficoll-løsning i et 50 ml rør og forsiktig lag 10 ml av en densitet 1,077 g / ml Ficoll løsning på toppen. Fortynn blodet med et like stort volum av PBS. Lag fortynnet blod nøye på dual layer Ficoll gradient, 20-25 ml per gradient. Sentrif…

Representative Results

Flowcytometrisk analysen for vurdering av kalsium mobilisering i menneskelige PMN Inkubering av neutrofiler med en konsentrasjon serie av syntetiske PSMα3 resulterer i hurtig aktivering målt ved kalsium-fluks, som er vist ved en økning i signalet i FL-1. Pre-inkubasjon av syntetisk PSMα3 med 0,01%, 0,1% eller 1% humant serum inhiberte signifikant evne til å fremkalle kalsium-flukser (figur 1). Analyse av GFP uttrykk i bakterier etter fagocytose av…

Discussion

I de fremgangsmåter som er beskrevet her noen trinn er meget kritisk. Vi vil markere disse her.

For isolering av nøytrofiler ved densitets-gradientsentrifugering er det viktig ikke å forstyrre lagene under eller etter sentrifugeringen trinn. Når aspirere de nøytrofile bruker en plast pipette, sørg for ikke å presse ballongen mens i lag med celler, vil som løser ut væske forstyrre lagene. Også visuelt inspisere pellet av nøytrofile etter osmotisk sjokk og sentrifugering trinn. Ders…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process