Studieren Wechselwirkungen von<em> Staphylococcus aureus</em> Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

Summary

Wir präsentieren Methoden, um die Wirkung von PSM und andere Giftstoffe ausgeschieden durch studieren<em> Staphylococcus aureus</em> Auf Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie.

Abstract

Wir präsentieren Methoden, um die Wirkung von Phenol löslich modulins (PSM) und andere Toxine und Staphylococcus aureus auf Neutrophilen sezerniert studieren. Um die Auswirkungen der PSM auf Neutrophilen wir isolieren frisch Neutrophilen mittels Dichtegradientenzentrifugation studieren. Diese Neutrophilen werden mit einem Farbstoff, der auf Calcium-Mobilisierung fluoresziert geladen. Die Aktivierung von Neutrophilen durch PSMs initiiert eine rasche und vorübergehende Erhöhung der freien intrazellulären Calcium-Konzentration. In einem Experiment Durchflusszytometrie diese rasche Mobilisation kann durch Überwachung der Fluoreszenz eines vorinstallierten Farbstoff, der auf die erhöhte Konzentration an freiem Ca ^{2 +} reagiert gemessen werden. Mit dieser Methode können wir bestimmen, die PSM-Konzentration notwendig, um die Neutrophilen zu aktivieren, und messen die Auswirkungen von spezifischen und allgemeinen Inhibitoren der Aktivierung von Neutrophilen.

Um die Expression der PSMs in den intrazellulären Raum, w untersuchene konstruiert haben Reporter Fusionen der Promotor des PSMα Operon zu GFP. Wenn diese Reporter Stämme von S. aureus durch Neutrophile phagozytiert werden, kann die Induktion der Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.

Introduction

Neutrophile (PMN) sind professionelle Fresszellen, die eine wichtige Rolle spielen bei der angeborenen Immunantwort gegen Staphylococcus aureus ^1. Der ständige Kampf zwischen Wirt und Mikrobe hat zu einem Wettrüsten der beiden führte. Kürzlich, community-associated (CA) Stämme von Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) sind entstanden, die zu sein scheinen sehr effizient in Umgehung der neutrophilen Tötung ^2,3. Übermäßige Phenol löslich modulin (PSMs) Produktion von CA-MRSA hat mit höherer Virulenz ^4,5 in Verbindung gebracht. Humanneutrophilen können diese PSMs über FPR2 die Aktivierung dieses G-Protein-gekoppelten Rezeptor ⁶ führen zu erkennen. Eines der frühesten Ereignisse ist die Mobilisierung von intrazellulären Speichern von Calcium (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} wirkt als sekundärer Botenstoff für eine Vielzahl von Effektor-Funktionen von PMNs einschließlich Degranulation und Phagozytose ^7. Daher Ca ^{2 +} ist ein sehr empfindlicher Indikator für dieFunktionsfähigkeit PSMs zu PMN aktivieren. Um die Auswirkungen von PSM auf Neutrophilen studieren, werden frische Neutrophilen isoliert und mit einem Farbstoff, der auf Calcium Mobilisierung fluoresziert geladen. In einem Experiment Durchflusszytometrie diese rasche Mobilisierung gemessen werden kann. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die direkte Auswirkungen von toxischen und anderen Komponenten auf Neutrophilen zu untersuchen und festzustellen, die niedrigste Konzentration, bei der diese aktiv sind. Für uns ist es ein sehr nützliches Werkzeug, um die Wirkung von vielen Proteinen von S. produziert studieren aureus in Immunevasion wie FPR2 hemmende Protein (FLIPR) ^8, FLIPR-like ⁷ und Chemotaxis hemmende Protein von Staphylococcus aureus (CHIPS) ⁹ beteiligt. All diese Proteine ​​haben gezeigt, dass das Calcium-Mobilisierung in Neutrophilen durch Bindung an den Rezeptor erkennt den Agonisten zu hemmen.

Vor kurzem hat unsere Gruppe beschrieben, dass PSMs funktionell gehemmt durch Serumlipoproteine ^{​​10 <}/ Sup>. Diese Lipoproteine ​​sind reichlich vorhanden im Blut und menschlichem Gewebe, was darauf hinweist, dass ihre Funktion ausüben PSMs vor allem in der intrazellulären Umgebung. Die Verfügbarkeit der Calciummobilisierung Assay erlaubt uns die präzise Messung der Wirkung von Serum-Lipoproteine ​​auf Aktivierung von Neutrophilen durch den PSM durch die erhebliche Hemmung durch sehr geringe Konzentrationen an Serum angegeben.

Da die PSMs funktionell gehemmt durch Serum, stellten wir die Hypothese, dass es eine wichtige Funktion für PSMs als intrazelluläre Toxine. Wir haben daher versucht, die Rolle der PSMs nach Phagozytose bestimmen. Um die Expression der PSMs in den interzellulären Raum zu untersuchen, haben wir Reporter Fusionen von dem Promotor des Operons psmα GFP konstruiert. Wenn diese Reporter Stämme von S. aureus durch Neutrophile wurden phagozytiert wurde die Induktion der Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet ^10. Offensichtlich kann diese technique ermöglicht die Untersuchung der Expression einer Vielzahl von Genen in S. aureus oder anderen Erregern nach Phagozytose. Da für S. aureus Überleben in der interzellulären Nische ist sehr wichtig, um das angeborene Immunsystem ^{11 10 12} zu überwinden, die Untersuchung der Rolle von Genen in dieser Nische aktiviert ist von großer Bedeutung für das Verständnis ihrer Virulenz.

Protocol

1. Isolation von PMN aus menschlichem Blut durch Dichtezentrifugation Unentschieden 5 9 ml Röhrchen heparinisierter venösen Blut. Bereiten Dual-Layer-Ficoll-Gradienten (4 Steigungen für 5 Gefäße Blut) wie folgt: Gießen Sie 12 ml mit einer Dichte von 1,119 g / ml Ficoll-Lösung in einem 50 ml-Tube und sorgfältig Schicht 10 ml mit einer Dichte von 1,077 g / ml Ficoll-Lösung an der Spitze. Man verdünnt das Blut mit einem gleichen Volumen von PBS. Schicht das verdünnte Blut…

Representative Results

Durchflusszytometrische Assay zur Beurteilung der Mobilisierung von Kalzium im menschlichen PMNs Inkubieren Neutrophilen mit einer Konzentration Reihe synthetischer PSMα3 wodurch eine schnelle Aktivierung durch Calcium-Fluss, der durch eine Erhöhung des Signals im FL-1 gezeigt, wird gemessen. Pre-Inkubation von synthetischen PSMα3 mit 0,01%, 0,1% oder 1% humanem Serum erheblich behindert die Fähigkeit, Kalzium Flüsse (Abbildung 1) zu entlocken. An…

Discussion

In der hier beschriebenen Verfahren einige Schritte sind sehr kritisch. Wir werden diese hier hervorzuheben.

Für die Isolierung von Neutrophilen durch Dichtegradientenzentrifugation ist es wichtig, die Schichten während oder nach der Zentrifugationsschritte stören. Wenn Ansaugen der Neutrophilen mit einem Kunststoff-Pipette, stellen Sie sicher nicht, um den Ballon zu quetschen, während in der Schicht von Zellen, wie Ausstoßen von Flüssigkeit werden die Schichten zu stören. Auch eine S…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process