の相互作用を研究<em>黄色ブドウ球菌</em>フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と

Summary

我々はによって分泌のPSMや他の毒素の影響を研究するための方法を提示<em>黄色ブドウ球菌</emフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡を用いて好中球>。

Abstract

私たちは、好中球上の黄色ブドウ球菌によって産生され、分泌されるフェノール可溶性のmodulins（PSMが）や他の毒素の影響を研究するための方法を提示する。我々は、密度勾配遠心分離を使用した新鮮な好中球を分離した好中球上のPSMの効果を研究する。これらの好中球は、カルシウム動員により蛍光を発する色素でロードされます。 PSMはによって好中球の活性化は、自由細胞内カルシウム濃度の急激かつ一過性の上昇を開始します。フローサイトメトリー実験で急速な動員は、遊離Ca ^{2 +}濃度の増加に反応プリロードされた色素の蛍光をモニターすることによって測定することができる。この方法で用いて、我々は、好中球を活性化し、好中球活性化の特異的かつ一般的な阻害剤の効果を測定する必要がPSMの濃度を決定することができる。

細胞内空間、WでのPSMの発現を調べるために、電子GFPへPSMαオペロンのプロモーターのレポーター融合を構築した。ときS.これらのレポーター株黄色ブドウ球菌は、好中球によって貪食され、発現の誘導は、蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。

Introduction

好中球（PMNは）は、 黄色ブドウ球菌 ¹に対する自然免疫応答において重要な役割を果たす専門の食細胞である。宿主と微生物の間に一定の戦いは双方の軍備競争につながっている。メチシリン耐性S.の最近では、コミュニティ関連（CA）の株黄色ブドウ球菌 （MRSA）は、好中球の殺害^2,3の回避は非常に効率的であるように見えることが浮上している。 CA-MRSAの過剰フェノール可溶性のモジュリン（のPSM）生産は^4,5高病原性と関連している。ヒト好中球は、このGタンパク質共役受容体⁶の活性化につながるFPR2を介してこれらのPSMを認識することができます。最古のいずれかのイベントは、カルシウムの細胞内貯蔵（のCa ^{2 +）}の動員である。 Ca ^{2 +}の脱顆粒と貪食⁷を含めたPMNのエフェクター機能の様々な二次メッセンジャーとして機能します。したがってのCa ^{2 +}の非常に敏感な指標であるたPMNを活性化するためのPSMの機能的能力。好中球上のPSMの効果を研究するために、新鮮な好中球がカルシウム動員により蛍光を発する色素を分離し、ロードされます。フローサイトメトリー実験で急速な動員を測定することができる。この方法を使用すると、好中に有毒で他の成分の直接的な影響を検討し、これらがアクティブである最低濃度を決定することができる。私たちにとって、それはS.によって生成された多くのタンパク質の効果を研究するための非常に便利なツールです黄色ブドウ球菌は、そのようなFPR2阻害タンパク質^{（FLIPR）8、7} FLIPRような、および黄色ブドウ球菌 ^（CHIPS）9の走化性阻害タンパク質として免疫回避に関与。すべてのこれらのタンパク質は、アゴニストを認識する受容体に結合することにより、好中球カルシウム動員を阻害することが示されている。

最近では、私たちのグループはのPSMは機能¹⁰血清リポタンパク質によって阻害されていることを説明した^</>（商標）。これらのリポタンパク質は、PSMは、主に細胞内環境でその機能を発揮することを示し、血液や人体組織内に豊富に存在している。カルシウム動員アッセイの有用性は、血清の非常に低濃度でかなりの阻害によって示されるように、私たちは正確にのPSMによる好中球の活性化に血清リポタンパク質の効果を測定することができました。

PSMは、機能的には、血清によって阻害されるので、細胞内毒素としてのPSMための重要な機能があるという仮説を立てた。したがって、我々は貪食後のPSMの役割を決定しようとした。細胞間隙でのPSMの発現を調べるために、我々は、GFPにpsmαオペロンのプロモーターのレポーター融合を構築した。ときS.これらのレポーター株黄色ブドウ球菌は、好中球によって貪食された、発現の誘導を、蛍光顕微鏡^10を用いて観測した。明らかに、このTEChniqueはS.で多数の遺伝子の発現の研究を可能にする貪食後に黄色ブドウ球菌や他の病原体。 S.のために導入されたバージョン細胞間のニッチで生き残る球菌は ^{11 10 12}自然免疫系を克服するために非常に重要であり、このニッチで活性化する遺伝子の役割を研究すると、その病原性を理解することに非常に関連しています。

Protocol

1。密度遠心分離によるヒト血液からのPMNの分離ヘパリン加静脈血の星9 mlチューブを描画します。 次のように二重の層フィコール勾配（5管の血のための4つの勾配）を準備：50 mlチューブで密度1.119グラム/ mlのフィコール溶液を12mlのその上に密度1.077グラム/ mlのフィコール溶液を注意深く層10ミリリットルを注ぐ。 PBS等量の血液を希釈する。 層のデュアルレイヤ?…

Representative Results

人間のPMNの内カルシウム動員の評価のためのフローサイトメトリーアッセイ FL-1におけるシグナルの増加によって示されるカルシウム流入によって測定されるように急速な活性化をもたらす合成PSMα3の濃度一連の好中球をインキュベートする。 0.01％で合成PSMα3のプレインキュベーション、0.1％または1％のヒト血清が大幅カルシウムフラックス（ 図1）を誘発す…

Discussion

ここで説明する方法では、いくつかのステップは非常に重要です。ここでは、これらをハイライト表示さ​​れます。

密度勾配遠心分離により好中球の単離のためには、遠心分離ステップの間または後に層を妨げないことが重要である。プラスチックピペットを用いて好中球を吸引すると、液体を吐出するレイヤーを邪魔するように、細胞の層の中に風船を圧迫しない?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process