دراسة تفاعلات<em> المكورات العنقودية الذهبية</em> مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري
Summary
نقدم أساليب لدراسة تأثير PSMS وغيرها من السموم التي يفرزها<em> المكورات العنقودية الذهبية</em> على العدلات باستخدام التدفق الخلوي ومضان المجهري.
Abstract
نقدم أساليب لدراسة تأثير modulins ذوبان الفينول (PSMS) وغيرها من السموم المنتجة ويفرز من قبل المكورات العنقودية الذهبية على العدلات. لدراسة الآثار المترتبة على PSMS على العدلات ونحن عزل العدلات الطازجة باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة. يتم تحميل هذه العدلات مع صبغة تتفلور على تعبئة الكالسيوم. تفعيل العدلات بواسطة PSMS يبدأ الزيادة السريعة وعابرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة. في تجربة التدفق الخلوي ويمكن قياس هذه التعبئة السريعة من خلال رصد مضان من صبغة محملة مسبقا أن يتفاعل مع زيادة تركيز الكالسيوم الحرة 2 +. باستخدام هذه الطريقة يمكننا تحديد تركيز PSM اللازمة لتفعيل العدلات، وقياس آثار مثبطات المحددة والعامة من تفعيل العدلات.
للتحقيق في التعبير عن PSMS في الفضاء داخل الخلايا، ثه وقد شيدت اندماج مراسل من المروج من الاوبرون PSMα إلى GFP. عندما تكون هذه السلالات مراسل S. والمبتلعة الذهبية من قبل العدلات، يمكن ملاحظة تحريض التعبير باستخدام المجهر مضان.
Introduction
العدلات (PMNs) هي البالعات المهنية التي تلعب دورا رئيسيا في الاستجابة المناعية الفطرية ضد المكورات العنقودية الذهبية 1. وقد قاد معركة مستمرة بين المضيف وميكروب إلى سباق تسلح من الاثنين معا. مؤخرا، المجتمع المصاحب (CA) سلالات مقاومة meticillin S. العنقودية الذهبية (الجرثومة) ظهرت الذي يبدو أن تكون فعالة جدا في التحايل على العدلة مقتل 2،3. ارتبط ذوبان modulin (PSMS) الإنتاج المفرط من الفينول CA-MRSA مع ارتفاع الفوعة 4،5. ويمكن التعرف على هذه العدلات الإنسان PSMS عبر FPR2 التي تؤدي إلى تفعيل هذا البروتين يقترن G-مستقبلات 6. واحدة من أقرب الأحداث هو تعبئة مخازن داخل الخلايا من الكالسيوم (كا 2 +). كا 2 + بمثابة رسول الثانوية لمجموعة متنوعة من المهام بما في ذلك المستجيب من PMNs تحبب والبلعمة 7. ولذلك كا 2 + هو مؤشر حساس جدا للالقدرات الوظيفية للPSMS لتفعيل PMNs. لدراسة آثار PSMS على العدلات، يتم عزل العدلات الطازجة ومحملة صبغة تتفلور على تعبئة الكالسيوم. في تجربة التدفق الخلوي ويمكن قياس هذه التعبئة السريعة. باستخدام هذا الأسلوب، فمن الممكن لدراسة الآثار المباشرة للمكونات السامة وغيرها من العدلات، وتحديد أقل تركيز في هذه التي هي بالموقع. بالنسبة لنا، بل هو أداة مفيدة جدا لدراسة تأثير العديد من البروتينات التي تنتجها S. المكورات المشاركة في التهرب المناعي، مثل FPR2 البروتين المثبطة (FLIPr) 8، FLIPr مثل 7، والانجذاب الكيميائي البروتين المثبطة من المكورات العنقودية الذهبية (رقائق) 9. وقد تبين أن كل هذه البروتينات لمنع تعبئة الكالسيوم في العدلات ملزمة لمستقبلات الاعتراف ناهض.
في الآونة الأخيرة، وقد وصفت مجموعتنا أن PSMS حرمانهم ظيفيا بواسطة البروتينات الدهنية في الدم 10 </ سوب>. هذه البروتينات الدهنية موجودة بوفرة داخل الدم والأنسجة البشرية، مشيرا إلى أن PSMS ممارسة وظيفتها في المقام الأول في البيئة داخل الخلايا. سمح بتوفر فحص تعبئة الكالسيوم لنا أن نقيس بدقة تأثير البروتينات الدهنية في الدم على تفعيل العدلات من قبل PSMS، يدل على ذلك تثبيط كبيرا من تركيزات منخفضة جدا من المصل.
منذ PSMS وتحول دون وظيفيا عن طريق المصل، ونحن افترضنا أن هناك وظيفة هامة لPSMS كما السموم داخل الخلايا. ولذلك سعينا إلى تحديد دور PSMS بعد البلعمة. للتحقيق في التعبير عن PSMS في الفضاء بين الخلايا، لقد شيدت اندماج مراسل من المروج من الاوبرون psmα إلى GFP. عندما تكون هذه السلالات مراسل S. تم المبتلعة الذهبية من قبل العدلات، تم ملاحظتها تحريض التعبير باستخدام المجهر مضان 10. ومن الواضح أن هذا تكhnique يسمح الدراسة للتعبير عن عدد كبير من الجينات في S. المذهبة أو الجراثيم الأخرى بعد البلعمة. منذ لS. الذهبية على قيد الحياة في محراب بين الخلايا مهم جدا للتغلب على نظام المناعة الفطرية 11 10 12، ودراسة دور الجينات تفعيلها في هذا المتخصصة هي ذات أهمية كبيرة لفهم شدته.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الأساليب المذكورة هنا بعض الخطوات هي حرجة للغاية. سوف نسلط الضوء هذه هنا.
لعزل العدلات بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة من المهم عدم تعكير صفو طبقات أثناء أو بعد الخطوات الطرد المركزي. عندما الشفط العدلات باستخدام ماصة بل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Molecular Probes / Life Technologies | F-1241 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | density 1.077 g/ml |
| Histopaque | Sigma | 11191 | density 1.119 g/ml |
| RPMI 1640 | Gibco, Life Technologies | 52400-025 | contains 25 mM HEPES and L-glutamine |
| Leica TCS SP5 microscope | Leica Microsystems, The Netherlands | TCS SP5 | objective: HCX PL APO 40X/0.85 |
| FACSCalibur | BD Biosciences | FACSCalibur | Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process |
References
- Rigby, K. M., DeLeo, F. R. Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections. Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).
- Voyich, J. M., et al. Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils. The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).
- Kobayashi, S. D., et al. Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus. J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).
- DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus. The Lancet. 375, 1557 (2010).
- David, M. Z., Daum, R. S. Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic. Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).
- Kretschmer, D., et al. Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus. Cell Host & Microbe. 7, 463 (2010).
- Prat, C., et al. A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR. J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).
- Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1. The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).
- de Haas, C. J., et al. Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent. The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).
- Surewaard, B. G. J., et al. Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles. PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).
- Kubica, M., et al. A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages. PLoS ONE. 3, e1409 (2008).
- Surewaard, B. G. J., et al. Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis. Cellular Microbiology. , (2013).
- Queck, S. Y., et al. RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus. Molecular Cell. 32, 150 (2008).
- Baban, C. K., et al. Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo. J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).
