تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط
Summary
ويرد وصف لكيفية معايرة نقل الطاقة الرنين فورستر أجهزة الاستشعار البيولوجية المتكاملة (أكذوبة) لالتنميط الأيضية في الموقع. وأكذوبة يمكن أن تستخدم لقياس مستويات الخلايا الأيض مساعدة noninvasively في تطوير نماذج التمثيل الغذائي والإنتاجية العالية فحص ظروف العمليات الحيوية.
Abstract
في عصر البيولوجيا الحاسوبية، ونظم تجريبية جديدة عالية الإنتاجية اللازمة من أجل تعبئة وصقل النماذج بحيث يمكن التحقق من صحة لأغراض التنبؤية. مثالي مثل هذه الأنظمة سيكون حجم منخفضة، ما يحول دون أخذ العينات والتحليلات المدمرة عندما تكون البيانات بالطبع الوقت التي يمكن الحصول عليها. ما هو مطلوب هو في أداة رصد الوضع الطبيعي الذي يمكن إبلاغ المعلومات اللازمة في الوقت الحقيقي وnoninvasively. خيارا للاهتمام هو استخدام الفلورسنت، وأجهزة الاستشعار البيولوجية في الجسم الحي كما صحفيين تركيزات داخل الخلايا القائم على البروتين. ويستند واحد من فئة معينة في الجسم الحي أجهزة الاستشعار التي وجدت تطبيقات في المستقلب الكمي على نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) بين اثنين من البروتينات الفلورية متصلة بواسطة مجال ملزم يجند. الحنق أجهزة الاستشعار البيولوجية المتكاملة (أكذوبة) ويتم إنتاج جوهري في خط الخلية، لديهم أوقات الاستجابة السريعة وتشا بهم الطيفيةracteristics تغيير على أساس تركيز المستقلب داخل الخلية. في هذه الورقة، وصفت طريقة لبناء الهامستر الصينية المبيض (شو) خطوط الخلايا التي تعبر عن جوهري على أكذوبة للالجلوكوز والجلوتامين ومعايرة أكذوبة في الجسم الحي في الثقافة خلية دفعة من أجل تمكين الكمي مستقبل تركيز المستقلب داخل الخلايا. يوضح البيانات من تغذيها دفعة CHO الثقافات الخلية أن أكذوبة كان قادرا في كل حالة للكشف عن التغير الناتج في تركيز داخل الخلايا. باستخدام إشارة الفلورسنت من أكذوبة ومنحنى المعايرة التي شيدت سابقا، تم تحديد تركيز الخلايا بدقة ما أكده مقايسة الأنزيمية المستقلة.
Introduction
رصد المستقلب لها تطبيقات مختلفة في التجهيز البيولوجي، بما في ذلك عملية التنمية، وسائل الإعلام وتصميم الأعلاف، والهندسة الأيضية. تتوفر لقياسات تركيز أساليب مختلفة من خلال استخدام الأنزيمية 1، 2 الكيميائية، أو المقايسات ملزمة 3. خيارا للاهتمام هو استخدام الفلورسنت، وأجهزة الاستشعار البيولوجية في الجسم الحي كما صحفيين من تركيز الخلايا الأيض الأساسية القائمة على البروتين. في المقايسات حجم منخفضة للغاية، مضان هو أداة مريحة كما التصغير يحسن فعلا نسبة 4،5 إشارة إلى الضوضاء وأجهزة الاستشعار القائم على البروتين المشفرة وراثيا يمكن أن لا معنى الكواشف الخارجية ضرورية لتحليل المستقلب. تتكون نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) أجهزة الاستشعار من اثنين من البروتينات الفلورية متصلة بواسطة مجال ملزم يجند. الحنق هو نقل nonradiative الطاقة من المانحين الصورة متحمس لمتقبل الفلورسنت جزيء المستخدمان إد على مقربة (<100). انشقاق يجند أو ملزم يؤدي إلى تغيير متعلق بتكوين جزئي في أجهزة الاستشعار، والتي، بدورها، يؤدي الى تغيير في القرب من fluorophores، مما يؤدي إلى تغيير في كفاءة الحنق يقاس التغير في طيف الانبعاث. ويتم إنتاج أجهزة الاستشعار البيولوجية الحنق المتكاملة (أكذوبة) جوهري في خط الخلية وتتغير خصائصها الطيفية استنادا إلى تركيز المستقلب داخل الخلية. أكذوبة ديهم أوقات الاستجابة السريعة مما يجعلها مثالية لأخذ القياسات لنماذج ديناميكية 6. وتشمل التطبيقات السابقة رصد احدة 7-9 ومتعددة 10 الأيض وتوفير بيانات عن توزيع 11 الزمانية المكانية. يمكن إنشاء أكذوبة في طرازين: آبو ماكس، حيث يجند ملزمة يعطل القرب من fluorophores خفض نقل الطاقة وآبو مين، حيث يجند ملزمة يجلب fluorophores اثنين في اتصال أوثق (الشكل 1).
_content "> في هذا العمل، ويرد على بروتوكول لبناء الهامستر الصينية المبيض (شو) خطوط الخلايا التي تعبر عن جوهري على أكذوبة لأيض الجلوكوز أو الجلوتامين. يتم تأسيس منهجية لمعايرة أجهزة الاستشعار في الجسم الحي لتمكين الكمي المستقبل قياسات تركيز المستقلب داخل الخلايا، كما وردت في الشكل 2. وبناء على هذا، فإن تركيز الجلوكوز داخل الخلايا أو الجلوتامين يمكن تحديد في تغذية على دفعات CHO الثقافات الخلية، التي تمت إضافتها المغذيات اثنين في تركيزات عالية في العملية. النتائج إثبات أن استخدام إشارة الفلورسنت من أكذوبة ومنحنى المعايرة التي شيدت سابقا، التنبؤ بدقة من تركيز الخلايا هو ممكن، على نحو ما أكده مقايسة الأنزيمية المستقلة. يوفر هذا الأسلوب مزايا كبيرة على التقنيات التحليلية الحالية لأنه موسع ومنخفضة التكلفة وبسرعة، وإعطاء إشارة في الوقت الحقيقي من الأكاذيب التي يمكن أن تكون الاثنينitored في جميع أنحاء الثقافة.Protocol
Representative Results
Discussion
وأكذوبة تمكين في الجسم الحي والكميات الموضع من الجزيئات الرئيسية في، في هذه الحالة المغذيات منظم النمو، وإزالة الشكوك الناجمة عن التبريد وأساليب الاستخراج. تشير النتائج أن هناك علاقة جيدة بين إشارة أكذوبة وتركيزات داخل الخلايا في نطاق 1-5 ملم للجلوكوز…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الأستاذ ولف فرومر (معهد كارنيجي للعلوم في جامعة ستانفورد) لتوفير يرجى لنا مع الجلوكوز الحنق البلازميد والدكتور أوفه Ludewig (جامعة هوهنهايم) لتتكرم تزويد الجلوتامين الحنق بناء مصنع في pUTKan التعبير النواقل. ويتم تمويل AB بواسطة برنامج منح دراسية BBSRC الأولوية المستهدفة. دعم كلا CK وKP بواسطة RCUK الزمالات في المستحضرات الصيدلانية البيولوجية المعالجة. ويود أيضا أن أشكر CK ونزا الحيوية للحصول على الدعم المالي. ويدعم مركز البيولوجيا الاصطناعية والابتكار بسخاء من قبل EPSRC.
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
Riferimenti
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
