Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin
Summary
In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Hesaplamalı biyoloji çağında, yeni yüksek kapasiteli deneysel sistemler onlar tahmin amacıyla valide böylece modelleri doldurmak ve rafine etmek için gereklidir. İdeal tür sistemler zaman ders veri elde edilecek zaman örnekleme ve yıkıcı analizlerini engeller düşük hacimli olacaktır. Gereken şey, gerçek-zamanlı ve noninvaziv gerekli bilgileri rapor edebilecekleri in situ izleme aracıdır. İlginç bir seçenek, floresan kullanılmasıdır, protein-bazlı hücre içi konsantrasyonlarının muhabir olarak in vivo biyolojik sensörler. Metabolit nicellendirmesinde bulmuştur in vivo biyosensör bir özel sınıfı, bir ligand bağlama alanı ile bağlanmış iki floresan protein arasında Förster rezonans enerji transferi (FRET) dayanmaktadır. Entegre biyolojik sensörler (FIBS) Fret yapıcı hücre hattı içinde üretilen, onlar hızlı yanıt süreleri ve spektral cha varhücre içindeki metabolitin konsantrasyonuna göre değişiklik tikleri. Bu yazıda, hücre içi metabolit konsantrasyonunun gelecek ölçümü sağlamak amacıyla yapısal olarak glikoz ve glutamin için bir ifade fibs (CHO) hücre çizgileri, Çin hamsteri yumurtalık yapımında ve toplu hücre kültüründe in vivo olarak fibs kalibre edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Beslemeli-kesikli CHO hücre kültürlerinden elde edilen veriler, FIBS hücre içi konsantrasyonunda elde edilen değişikliği tespit etmek için, her durumda mümkün olduğunu göstermektedir. Bağımsız bir enzimatik deneyi ile teyit edildiği gibi FIBS ve daha önceden oluşturulan kalibrasyon eğrisinden floresan sinyalini kullanarak, hücre içi konsantrasyonu tam olarak tespit edilmiştir.
Introduction
Metaboliti izleme süreç geliştirme, medya ve yem tasarım ve metabolik mühendislik dahil bioprocessing çeşitli uygulamalar vardır. Çeşitli yöntemler enzimatik 1, kimyasal 2, 3 ya da bağlama deneylerinde kullanımıyla konsantrasyonu ölçümleri için kullanılabilir. İlginç bir seçenek, floresan kullanılmasıdır, protein bazlı anahtar metabolitlerin hücre içi konsantrasyonunun muhabir olarak in vivo biyolojik sensörler. Küçültme aslında sinyal-gürültü oranı, 4,5 artırır ve protein bazlı sensörler eksojen genetik olarak reaktif metabolit analizi için gerekli olduğu anlamını kodlanabilir gibi ultra-düşük hacim deneylerinde, floresan bir araçtır. Förster rezonans enerji transferi (FRET) biyosensörler bir ligand bağlama alanı ile bağlanmış iki floresan protein oluşur. FRET bir alıcı, flüoresan molekül locat bir fotoğraf eksitasyonlu bir vericiden bir radyatif olmayan enerji transferi yakın (<100) ed. Ligand bağlayıcı bir bölünme ya da sırayla, emisyon spektrumunda bir değişiklik ile ölçüldüğü FRET veriminde bir değişime yol açan, florofor yakın bir değişim olmaktadır, sensörün bir konformasyonel değişikliği neden olur. FRET entegre biyolojik sensörleri (FIBS) yapıcı hücre hattı içinde üretilir ve spektral özellikleri, hücre içinde metabolitin konsantrasyonuna göre değişir. FIBS dinamik modellerin 6 ölçümler için idealdir hızlı tepki süreleri var. Önceki uygulamaların 7-9 tekli ve çoklu 10 metabolitleri izleme ve uzaysal dağılımı 11 veri sağlayan içerir. Ligand bağlama enerjisi transferi ve bir ligand bağlanma yakın temas eder (Şekil 1) içine, iki florofor getirir Apo-Min, düşürücü florofor yakınlığını bozan Apo-Max,: FIBS iki konfigürasyonlarda oluşturulabilir.
Bu çalışmada _content ">, bir protokol kurucu bir metaboliti, glukoz ya da glutamin için bir ifade fibs (CHO) hücre çizgileri, Çin hamsteri yumurtalık oluşturmak için sunulmuştur. bir yöntem, in vivo olarak, sensörün kalibrasyonu için kurulur gelecek Quantitative etkinleştirme Şekil 2'de gösterildiği gibi. Buna göre hücre içi metabolit konsantrasyonunun ölçümleri, glukoz veya glutamin hücre içi konsantrasyonu, iki besin işlemdeki yüksek konsantrasyonlarda ilave edildi için, beslemeli-kesikli CHO hücre kültürlerinde tespit edilebilir. sonuçlar Bu invaziv olmayan, düşük maliyetli olduğundan bağımsız enzimatik deneyi ile teyit edildiği gibi FIBS ve daha önceden oluşturulan kalibrasyon eğrisinden floresan sinyali kullanarak, hücre içi konsantrasyonunun doğru tahmini mümkün olduğunu göstermektedir. bu yöntem mevcut analitik teknolojiler üzerinde önemli avantajlar sunar ve hızlı mon olabilir FIBS bir gerçek-zamanlı sinyal vererekkültür boyunca itored.Protocol
Representative Results
Discussion
FIBS yöntem söndürülmesi ve ekstraksiyon kaynaklanan engelleyerek Bu durumda, büyüme sınırlayıcı besin in, in vivo ve di önemli moleküllerin in situ olarak nicelendirilmesi sağlar. Bulgular FIBS sinyal ve glutamin için glikoz ve 0,3-2 mm 1-5 mM aralığı içinde, hücre içi konsantrasyonları arasında iyi bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. Toplu CHO hücre kültürü, bu konsantrasyonlar, üstel sabit ve erken aşamalarında düşüş rastlanmaktadır. Üstel ve durağ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz nazik pUTKan bitki ekspresyon vektörü olarak inşa FRET glutamin temini için plazmid ve Dr Uwe Ludewig (Hohenheim Üniversitesi) Fret nazik glikoz ile bize sağladığı için Profesör Kurt Frommer (Bilim Carnegie Enstitüsü, Stanford Üniversitesi) teşekkür ederim. AB BBSRC Hedefli Öncelik Studentships programı tarafından finanse edilmektedir. CK ve KP Hem Biopreparatlar İşleme RCUK Bursu tarafından desteklenmektedir. CK da mali destek için Lonza Biologies teşekkür etmek istemektedir. Sentetik Biyoloji ve Yenilik Merkezi cömertçe EPSRC tarafından desteklenmektedir.
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
Riferimenti
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
