FIBS-permis non invasive au profil métabolique
Summary
Une description de la façon d'étalonner les capteurs de transfert Förster Resonance Energy intégrés biologiques (mensonges) pour le profilage métabolique in situ est présentée. Les FIBS peuvent être utilisés pour mesurer les niveaux de métabolites intracellulaires aider de manière non invasive dans le développement de modèles métaboliques et criblage à haut débit de conditions de bioprocédés.
Abstract
À l'ère de la biologie computationnelle, de nouveaux systèmes expérimentaux à haut débit sont nécessaires afin de remplir et d'affiner les modèles de sorte qu'ils peuvent être validées à des fins prédictives. Idéalement, de tels systèmes seraient faible volume, ce qui exclut d'échantillonnage et les analyses destructives lorsque des données de cours du temps doivent être obtenus. Ce qui est nécessaire est un outil de surveillance in situ qui peuvent rapporter les informations nécessaires en temps réel et de façon non invasive. Une solution intéressante est l'utilisation de fluorescence, dans des capteurs biologiques in vivo que les reporters de concentrations intracellulaires à base de protéines. Une classe particulière de biocapteurs in vivo qui ont trouvé des applications dans métabolite quantification est basée sur le transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) entre deux protéines fluorescentes reliés par un domaine de liaison du ligand. FRET capteurs biologiques intégrés (mensonges) sont constitutivement produites dans la lignée cellulaire, ils ont un temps de réponse rapide et leur cha spectraletiques changer en fonction de la concentration de métabolite dans la cellule. Dans le présent document, le procédé de construction d'ovaire de hamster chinois (CHO), des lignées cellulaires qui expriment de manière constitutive un FIBS de glucose et de la glutamine et l'étalonnage des FIBS in vivo dans une culture cellulaire par lots afin de permettre la quantification future de la concentration en métabolite intracellulaire est décrite. Les données de fed-batch cultures de cellules CHO démontre que les FIBS a pu dans chaque cas, de détecter la variation résultante de la concentration intracellulaire. En utilisant le signal fluorescent à partir des FIBS et la courbe d'étalonnage construite précédemment, la concentration intracellulaire a été déterminée avec précision telle que confirmée par un essai enzymatique indépendante.
Introduction
suivi de métabolite a diverses applications dans les procédés biotechnologiques, y compris le processus de développement, les médias et la conception d'alimentation, et de l'ingénierie métabolique. Diverses méthodes sont disponibles pour la mesure de concentration à l'aide d'une enzymatique, chimique 2, ou des dosages de liaison 3. Une solution intéressante est l'utilisation de fluorescence, dans des capteurs biologiques in vivo que les reporters de la concentration intracellulaire des métabolites principaux à base de protéines. Dans les essais de volume ultra-bas, la fluorescence est un outil pratique que la miniaturisation améliore réellement le taux de 4,5 signal-sur-bruit et des capteurs à base de protéines peut être génétiquement codé sens qu'aucun réactifs exogènes sont nécessaires pour l'analyse des métabolites. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biocapteurs sont constitués de deux protéines fluorescentes reliés par un domaine de liaison du ligand. FRET est un transfert non radiatif de l'énergie à partir d'un donneur de photo-excitation à un accepteur fluorescent molécule locat ed à proximité (<100). Le clivage de la liaison du ligand ou provoque un changement conformationnel dans le capteur, ce qui, à son tour, induit un changement dans la proximité des fluorophores, ce qui conduit à un changement de l'efficacité de FRET mesuré par le changement dans le spectre d'émission. Des capteurs biologiques intégrés (FRET) sont constitutivement FIBS produits dans la lignée de cellules et leurs caractéristiques spectrales changent en fonction de la concentration du métabolite dans la cellule. FIBS ont des temps de réponse rapide qui les rend idéales pour prendre des mesures pour les modèles dynamiques 6. Applications précédentes comprennent la surveillance simples 7-9 et plusieurs métabolites 10 et fournir des données sur la répartition spatio-temporelle 11. FIBS peuvent être créés dans deux configurations: Apo-Max, où la liaison du ligand perturbe la proximité des fluorophores abaissement transfert d'énergie et Apo-Min, où la liaison du ligand apporte les deux fluorophores en contact plus étroit (figure 1).
_content "> Dans ce travail, un protocole est présenté pour la construction d'ovaire de hamster chinois (CHO), des lignées cellulaires qui expriment de manière constitutive un FIBS pour un métabolite, le glucose ou la glutamine. Une méthodologie est établie pour l'étalonnage du capteur in vivo pour permettre à l'avenir quantitative des mesures de concentration de métabolite intracellulaire, tel que présenté dans la figure 2. Sur cette base, la concentration intracellulaire de glucose ou de la glutamine peuvent être déterminées en fed-batch CHO cultures de cellules, dans laquelle les deux éléments nutritifs ont été ajoutés à des concentrations élevées en cours de fabrication. Les résultats démontrent que l'utilisation du signal de fluorescence à partir des FIBS et la courbe d'étalonnage construite précédemment, avec précision la prédiction de la concentration intracellulaire est possible, comme l'a confirmé par un test enzymatique indépendante. Cette méthode offre des avantages substantiels par rapport aux technologies d'analyse de courant, car il est peu coûteux non invasive et rapide, donnant un signal en temps réel des FIBS qui peuvent être monitored tout au long de la culture.Protocol
Representative Results
Discussion
Les FIBS permettent in vivo et la quantification in situ des molécules clés dans, dans ce cas des nutriments limitant la croissance, éliminer les incertitudes découlant de la trempe et de l'extraction des méthodes. Les résultats suggèrent qu'il existe une bonne corrélation entre le signal de FIBS et les concentrations intracellulaires de l'ordre de 1-5 mM pour le glucose et 0,3-2 mM pour la glutamine. Dans le lot CHO culture cellulaire, ces concentrations sont rencontrées …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions M. Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, l'Université de Stanford) d'avoir bien voulu nous fournir le glucose FRET plasmide et le Dr Uwe Ludewig (Université Hohenheim) pour fournir de bien vouloir la glutamine FRET construction dans l'usine vecteur d'expression pUTKan. AB est financé par le programme des Bourses d'études prioritaires BBSRC ciblée. La CK et KP sont pris en charge par des bourses RCUK en traitement Biopharmaceuticals. CK tient également à remercier Lonza Biologics pour leur soutien financier. Le Centre pour la biologie synthétique et d'innovation est généreusement soutenu par l'EPSRC.
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
Riferimenti
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