अवेध्य चयापचय रूपरेखा fibs सक्षम
Summary
सीटू चयापचय रूपरेखा में के लिए फोरस्टर प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण एकीकृत जैविक सेंसर (fibs) जांचना करने का एक विवरण प्रस्तुत किया है. Fibs noninvasively चयापचय मॉडल और बायोप्रोसैस शर्तों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के विकास में सहायता मेटाबोलाइट्स के intracellular स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
कम्प्यूटेशनल बायोलॉजी के युग में, नए उच्च throughput प्रायोगिक प्रणाली वे भविष्य कहनेवाला प्रयोजनों के लिए मान्य किया जा सकता है, ताकि मॉडल आबाद और परिष्कृत करने के क्रम में आवश्यक हैं. आदर्श रूप में इस तरह की व्यवस्था समय बेशक डेटा प्राप्त हो रहे हैं जब नमूना और विनाशकारी विश्लेषण precludes जो कम मात्रा होगा. क्या जरूरत है वास्तविक समय में और noninvasively आवश्यक जानकारी रिपोर्ट कर सकते हैं जो एक में सीटू निगरानी उपकरण है. एक दिलचस्प विकल्प फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल होता है, प्रोटीन आधारित intracellular सांद्रता के संवाददाताओं के रूप में विवो जैविक सेंसर में. Metabolite मात्रा का ठहराव में आवेदन मिल गया है कि vivo में biosensors के एक विशेष वर्ग के एक ligand बाध्यकारी डोमेन से जुड़े दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच फोरस्टर प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) पर आधारित है. एकीकृत जैविक सेंसर (fibs) झल्लाहट अनिवार्यता से सेल लाइन के भीतर उत्पादन कर रहे हैं, वे तेजी से प्रतिक्रिया समय और उनके वर्णक्रमीय चा हैकक्ष के भीतर metabolite की एकाग्रता पर आधारित बदल racteristics. इस पत्र में, intracellular metabolite एकाग्रता का भविष्य मात्रा का ठहराव सक्षम करने के क्रम में रचनात्मक रूप में ग्लूकोज और glutamine के लिए एक fibs कि एक्सप्रेस (चो) सेल लाइनों चीनी हम्सटर अंडाशय के निर्माण और बैच सेल संस्कृति में vivo में fibs औजार के लिए विधि वर्णित है. खिलाया बैच चो सेल संस्कृतियों से डाटा fibs intracellular एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रत्येक मामले में सक्षम था कि यह दर्शाता है. एक स्वतंत्र एंजाइमी परख द्वारा पुष्टि के रूप में fibs और पहले से निर्माण किया अंशांकन वक्र से फ्लोरोसेंट संकेत का उपयोग करना, intracellular एकाग्रता सही निर्धारित किया गया था.
Introduction
Metabolite निगरानी प्रक्रिया विकास, मीडिया और चारा डिजाइन, और चयापचय इंजीनियरिंग सहित Bioprocessing में विभिन्न अनुप्रयोगों, है. विभिन्न तरीकों एंजाइमी 1, रासायनिक 2, या बाध्यकारी assays 3 के प्रयोग के माध्यम से एकाग्रता माप के लिए उपलब्ध हैं. एक दिलचस्प विकल्प फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल होता है, प्रोटीन आधारित कुंजी मेटाबोलाइट्स के intracellular एकाग्रता के संवाददाताओं के रूप में विवो जैविक सेंसर में. Miniaturization वास्तव में संकेत करने वाली शोर अनुपात 4,5 सुधार और प्रोटीन आधारित सेंसर आनुवंशिक रूप से कोई एक्सोजेनस अभिकर्मकों metabolite विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं कि अर्थ इनकोडिंग जा सकता है के रूप में अल्ट्रा कम मात्रा assays में प्रतिदीप्ति एक सुविधाजनक उपकरण है. Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) biosensors एक ligand बाध्यकारी डोमेन से जुड़े दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन से मिलकर. झल्लाहट एक स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट अणु locat के लिए एक फोटो उत्साहित दाता से ऊर्जा का एक nonradiative हस्तांतरण है करीब निकटता (<100) में एड. Ligand दरार या बंधन बारी में, उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में बदलाव से मापा झल्लाहट दक्षता में एक परिवर्तन के लिए अग्रणी fluorophores की निकटता में एक परिवर्तन लाती है, जो सेंसर में एक गठनात्मक परिवर्तन का कारण बनता है. झल्लाहट एकीकृत जैविक सेंसर (fibs) अनिवार्यता से सेल लाइन के भीतर उत्पादन कर रहे हैं और उनके वर्णक्रमीय विशेषताओं सेल के भीतर metabolite की एकाग्रता के आधार पर बदल. Fibs गतिशील मॉडल 6 माप लेने के लिए उन्हें आदर्श के तेजी से प्रतिक्रिया समय है. पिछला अनुप्रयोगों 7-9 एकल और एकाधिक 10 मेटाबोलाइट्स निगरानी और spatiotemporal वितरण 11 पर डाटा उपलब्ध कराने में शामिल हैं. Ligand बाध्यकारी ऊर्जा हस्तांतरण और ligand बाध्यकारी करीब संपर्क (चित्रा 1) में दो fluorophores लाता है जहां ए पी ओ मिन, कम करने fluorophores की निकटता बाधित जहां APO-मैक्स,: fibs दो विन्यास में बनाया जा सकता है.
इस काम में _content ">, एक प्रोटोकॉल अनिवार्यता से एक metabolite, ग्लूकोज या glutamine के लिए एक fibs कि एक्सप्रेस (चो) सेल लाइनों चीनी हम्सटर अंडाशय के निर्माण के लिए प्रस्तुत किया है. एक पद्धति विवो में सेंसर की जांच के लिए स्थापित किया है, भविष्य मात्रात्मक सक्षम करने के लिए चित्रा 2 में प्रस्तुत किया. इस आधार पर intracellular metabolite एकाग्रता की माप, ग्लूकोज या glutamine के intracellular एकाग्रता जो दो पोषक तत्वों में प्रक्रिया उच्च सांद्रता में जोड़ा गया था करने के लिए, फेड बैच चो सेल संस्कृतियों में निर्धारित किया जा सकता है. परिणाम यह noninvasive, कम लागत वाली है क्योंकि एक स्वतंत्र एंजाइमी परख द्वारा पुष्टि के रूप में fibs और पहले से निर्माण किया अंशांकन वक्र से फ्लोरोसेंट संकेत का उपयोग कर, intracellular एकाग्रता की सही भविष्यवाणी, संभव है कि प्रदर्शित करता है. इस विधि वर्तमान विश्लेषणात्मक तकनीकों में काफी लाभ प्रदान करता है और, तेजी से सोम हो सकता है कि fibs के एक वास्तविक समय संकेत दे रही हैसंस्कृति भर itored.Protocol
Representative Results
Discussion
Fibs तरीकों शमन और निष्कर्षण से उत्पन्न होने वाली अनिश्चितताओं को दूर करने, इस मामले वृद्धि को सीमित पोषक तत्वों में vivo में और कुंजी अणुओं की सीटू quantitation में सक्षम. निष्कर्ष fibs संकेत और glutamine के लिए ग?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हमारा अनुरोध है pUTKan संयंत्र अभिव्यक्ति वेक्टर में निर्माण झल्लाहट glutamine की आपूर्ति के लिए प्लाज्मिड और डा. Uwe Ludewig (Hohenheim विश्वविद्यालय) झल्लाहट कृपया ग्लूकोज के साथ हमें प्रदान करने के लिए प्रोफेसर वुल्फ Frommer (विज्ञान के लिए कार्नेगी संस्थान, स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) धन्यवाद. अटल बिहारी बीबीएसआरसी लक्षित प्राथमिकता Studentships कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित है. सी और केपी दोनों बायोफार्मास्यूटिकल्स प्रसंस्करण में RCUK फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं. सी.के. भी उनके वित्तीय समर्थन के लिए Lonza बायोलॉजिक्स शुक्रिया अदा करना चाहती है. सिंथेटिक जीव विज्ञान और अभिनव के लिए केंद्र उदारता EPSRC द्वारा समर्थित है.
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
Riferimenti
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