Una descrizione di come calibrare trasferimento Förster Resonance Energy sensori biologici integrati (FIBS) per in situ profilo metabolico è presentato. Le FIBS possono essere utilizzati per misurare i livelli intracellulari di metaboliti non invasivo aiutando nello sviluppo di modelli metabolici e high throughput screening delle condizioni bioprocesso.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nell'era della biologia computazionale, i nuovi sistemi sperimentali ad alto rendimento sono necessarie per compilare e perfezionare i modelli in modo che possano essere convalidati a fini predittivi. Idealmente tali sistemi sarebbero basso volume, che preclude campionamento e analisi distruttive quando i dati del corso tempo si vogliono ottenere. Ciò che occorre è un strumento di monitoraggio in situ che possono comunicare le informazioni necessarie in tempo reale e in maniera non invasiva. Un'opzione interessante è l'uso di fluorescente, sensori biologici in vivo segnalanti concentrazioni intracellulari base di proteine. Una classe particolare di biosensori in vivo che ha trovato applicazioni in metabolita quantificazione si riferiscono al trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) tra due proteine fluorescenti collegati da un dominio di legame al ligando. FRET sensori biologici integrati (FIBS) sono costitutivamente prodotte all'interno della linea cellulare, hanno tempi di risposta veloci e il loro cha spettralestiche variare in funzione della concentrazione del metabolita all'interno della cellula. In questo documento, il metodo per la costruzione di ovaio di criceto cinese (CHO) linee cellulari che esprimono costitutivamente un FIBS per il glucosio e glutammina e calibrare le FIBS in vivo in coltura cellulare in batch per consentire futuro quantificazione della concentrazione di metabolita intracellulare è descritto. I dati di fed-batch colture di cellule CHO dimostra che i FIBS è stato in grado in ogni caso a rilevare il conseguente cambiamento della concentrazione intracellulare. Utilizzando il segnale fluorescente dalle FIBS e la curva di taratura precedentemente costruita, la concentrazione intracellulare è stata determinata con precisione come confermato mediante saggio enzimatico indipendente.
Introduzione
Monitoraggio metabolita ha varie applicazioni in bioprocessi, compreso lo sviluppo di processo, media e il design dei mangimi, e l'ingegneria metabolica. Vari metodi sono disponibili per le misure di concentrazione attraverso l'uso di 1 enzimatica, chimico 2, o saggi di legame 3. Un'opzione interessante è l'uso di fluorescente, sensori biologici in vivo come reporter della concentrazione intracellulare di metaboliti principali a base di proteine. In saggi ultra-basso volume, fluorescenza è uno strumento utile come miniaturizzazione migliora anche il rapporto 4,5 segnale-rumore e sensori a base di pr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Cella linea Revival e manutenzione
- Revive cellule CHO in 9 ml CD-CHO medio integrato con 8 mM L-glutammina e 10 ml / L integratore 100x ipoxantina / timidina (terreno di coltura completo).
- Centrifugare a 100 xg per 5 min.
- Risospendere le cellule in 10 ml di fresco mezzo di crescita integrale.
- Rimuovere un campione di 1 ml e determinare la concentrazione di cellule vitali mediante microscopio ottico utilizzando il metodo esclusione del colorante blu tripano in un emocitometro.
- Avviare una coltura ad una densità di semina di 3 x 10 5 cellule / ml in 125 ml agitare palloni.
- Mantenere la cultura i....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Una panoramica della metodologia è presentato in Figura 2. Nel lavoro qui presentato, cellule CHO sono state transfettate con il vettore FIBS e linee cellulari stabili sono stati selezionati con una pressione antibiotico di 400 mcg / ml Zeocin. Due linee separate cellulari stabili esprimenti costitutivamente i sensori di glucosio e glutammina sono stati quindi creati. Figura 1 illustra le configurazioni delle due biosensori utilizzati in questo studio. Il sensore di glucosio si basa sul.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Le FIBS permettono in vivo e in situ quantificazione di molecole chiave, in questo caso nutrienti crescita limitativo, eliminando incertezze derivanti da tempra e metodi di estrazione. I risultati suggeriscono che vi è una buona correlazione tra il segnale FIBS e le concentrazioni intracellulari nell'intervallo 1-5 mM di glucosio e 0,3-2 mM di glutammina. Nel lotto coltura cellulare CHO, queste concentrazioni si incontrano nelle fasi di declino esponenziale, stazionarie, e le prime. Le fasi esponen.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il professor Lupo Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) per averci gentilmente fornito con il glucosio FRET plasmide e il Dr. Uwe Ludewig (Hohenheim University) per fornire gentilmente la glutammina FRET costrutto nel pUTKan pianta vettore di espressione. AB è finanziato dal programma di Borse di studio prioritari BBSRC mirata. Sia CK e KP sono supportati da RCUK Borse in Biopharmaceuticals Processing. CK desidera inoltre ringraziare Lonza Biologics per il loro sostegno finanziario. Il Centro per la biologia sintetica e l'innovazione è generosamente supportato dal EPSRC.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | varierà a seconda degli obiettivi dello studio |
| vettore pCDNA4/TO | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Reagente per trasfezione | Mirus Bio | MIR 5700 | Le trasfezioni possono essere effettuate utilizzando qualsiasi metodo adatto alla linea cellulare in studio |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Il mezzo di crescita cellulare dipende dalle cellule in studio |
| 100x HT Supplement | Life Tecnologie | 11067-030 | |
| L-Glutammina 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| Lettore di piastre InfinitePRO 200 | Tecan | FLx800TBI | Qualsiasi lettore di piastre a fluorescenza a 96 pozzetti in grado di accedere alle lunghezze d'onda richieste può essere sostituito |
| Filtri per lettore di piastre | |||
| Maxiprep | Qiagen | 12163 | Qualsiasi kit adatto può essere sostituito Amplex |
| Kit per il dosaggio del glucosio/glucosio ossidasi rosso | Invitrogen | A22189 | Qualsiasi kit adatto può essere sostituito |
| EnzyChrom Kit per il dosaggio della glutammina | Sistemi di analisi biologica | EOAC-100 | Qualsiasi kit adatto può essere sostituito |
| Emocitometro Neubauer migliorato | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubatore | Nuaire | NU-5510E |
Riferimenti
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal.....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
Biosensori biologici integrati FRETprofilazione dei metaboliti intracellularicellule di ovaio di criceto cinesetrasferimento di energia tra risonanze di fluorescenzamonitoraggio non invasivo di biosensoricoltura cellulare in fed-batchrilevamento di glutammina e glucosioselezione della trasfezione plasmidicamisurazione del rapporto di fluorescenzavalidazione del saggio enzimatico
