不像无细胞的HIV-1颗粒,感染的CD4 + T细胞是由浆细胞样树突细胞(pDC细胞)有效地感测。这个手稿描述了一种方法,其中外周血单核细胞(PBMC)或分离的pDC是共培养的HIV-1感染的T细胞的pDC评估先天感测的评估,I型干扰素的释放。
HIV-1的固有感测需要感染的CD4 + T细胞与浆细胞样树突细胞(pDC细胞)直接接触。为了研究这个过程中,此处所描述的协议使用新鲜分离的人外周血单核细胞(PBMC)或浆细胞样树突细胞(pDC细胞)以感测在任一T细胞系(MT4)或异源的原代CD4 + T细胞感染。为了确保正确的感测,至关重要的是,将PBMC采血和被感染的T细胞的所使用的最佳百分比后立即分离。此外,多参数流式细胞染色可用于确认PBMC样品含有不同细胞谱系在生理比率。一些控制也可包括评估生存能力和的pDCs的功能。这些包括,特定表面标志物的存在下,评估细胞反应Toll样受体激动剂已知(TLR)的途径,和确认缺乏斯波的taneous I型干扰素(IFN)的生产。在这个系统中,新鲜分离的PBMC或pDC细胞共培养与HIV-1感染的细胞在96孔板为18-22小时。从这些共培养物的上清液,然后用于通过监测ISGF3通路在HEK-蓝IFN-α/β细胞的活化,以确定生物活性的I型IFN的水平。事先和在共培养条件下,靶细胞可以经过流式细胞仪分析,以确定多个参数,包括感染细胞的杀伤差动感染细胞的百分比,特定表面标志物的水平,和。虽然这些协议最初开发到后续的I型干扰素的产生,它们可能被用来研究来自pDC细胞释放其他imuno-调节分子,并进一步了解理事HIV-1先天敏感的分子机制。
I型干扰素生成的pDC表示防御病毒感染的第一道防线,并且因此作为先天免疫和适应性免疫1之间的重要环节。而不含细胞的HIV-1的颗粒是通过先天免疫系统检测到不良的HIV-1感染的 CD4 + T细胞通过的pDC 2有效地检测到。所述感测机构,需要在PDC上,然后接着病毒捕获和内由PDC被感染的T细胞和CD4分子的表面上的病毒包膜糖蛋白(gp120的)之间的初始接触。由TLR7后续识别的转移的HIV-1 RNA的触发MYD88 / IRF7途径的活化,并最终导致I型IFN的产生3。重要的是,第二感测途径中存在的pDCs,这是由TLR9介导的,由病毒糖蛋白,gp120的相互作用的抑制,与PDC特异性表面标记BDCA2 4。
<p class="jove_content">的pDC的TLR7和TLR9传感途径可以潜在地负面BST2的接合(也被指定Tetherin或CD317)与称为ILT7 5另一个的pDC-比表面抑制性受体调制。 BST2被以高水平表达的pDC在和一些癌细胞的表面上,但在相对较低的水平,其他类型的细胞,如B细胞,巨噬细胞和T细胞。重要的是,BST2可以通过I型干扰素在一些转化细胞系的,以及在人类和小鼠起源6的原代细胞培养诱导。除了 其免疫调节功能,BST2最近发现抑制HIV-1的释放和其它包膜病毒颗粒由交联新生病毒颗粒到感染细胞表面 7。在HIV-1的情况下,该病毒编码辅助蛋白U(VPU)被证明作为BST2拮抗剂。据信,VPU下调BST2来自HIV-1感染的细胞的细胞表面上,它的系绳的部位荷兰国际集团的活性,其结果增强了病毒释放和传播7,虽然这一概念已被质疑8,9。在没有VPU,大量的完全成形的和成熟的子代的HIV-1颗粒被保留在细胞表面。无论这些拴颗粒可能代表免疫检测有效的目标仍然是一个悬而未决的问题。此外,目前还不清楚VPU是否能够通过调节表面BST2水平dysregulate I型IFN的产生从pDC细胞。旨在评估HIV-1的感测早期研究用无细胞HIV-1的颗粒,其一般被认为是I型干扰素3,10-12的差诱导剂进行。鉴于最近的研究显示,PBMC和pDC的有效检测HIV感染的CD4 + T淋巴细胞2,13,14,我们在这里介绍一个简单的方法来衡量在识别HIV-1感染细胞的体外pDC的触发先天的反应。
这里所描述的协议测检测感染了GFP标记的HIV-1病毒仅会有不同的表达VPU能力,在我们最近的一份报告18中描述的T细胞。但是,这些方法可以很容易地进行修改,以研究传感未标记病毒以及缺乏其它病毒基因可能潜在调节先天传感病毒。如果使用不表达GFP的病毒,感染的靶细胞的百分比应通过共同培养,如p24的(衣壳)细胞内染色和流式细胞术或通过p24的ELISA现有的另一种手段来确定。此外,这些协议可以使用不同的靶T细胞在内的各种可用的细胞系和原代细胞。
时相比,用于研究HIV-1的感测方法早在本手稿中描述的方法具有许多优点。首先它已经建立由多个基团的无细胞的HIV-1 P文章是I型干扰素2,13,14不良诱导。此外,早期的研究依赖于较旧的IFNα基于ELISA的方法来量化的I型干扰素的产生量。这种检测技术的局限性是,大多数老IFNαELISA试剂盒仅测量一种类型的IFNα,而忽略了其他类型的IFNα和IFNβ的。使用所描述的报道细胞系的克服了这一限制作为人类I型IFN的所有生物活性形式的浓度可以一次进行测定。该技术是高度敏感的,比新产生的IFN ELISA试剂盒和用于许多捐助者可以很容易地检测出大量的I型干扰素的成本更低。然而,该协议可以很容易地适于与其他的I型干扰素的读出的方法,如ELISA中使用。
关键步骤:重要的是,所有的细胞成分(包括靶和效应)的质量进行严格控制。潜在的污染,即使当asymptomatic,需要被监视和控制。正如我们前面所提到的,抗生素控制无症状细菌污染,以及潜在的其他细胞内病原体如支原体,可以产生类似的免疫应答的那些后HIV-1感染,即生产的I型干扰素的观察。此外,所有的试剂需要自由LPS或其他潜在的内毒素。同样,监测PBMC和的pDCs也是很重要的,因为人类样本通常可以通过底层持续感染,这可能会影响正常传感打底。我们建议总是包括建议的阴性对照,例如没有靶细胞,以及与模拟感染的细胞共培养。受感染的细胞的存活力也是正确的pDC传感自I型干扰素不产生以下共培养细胞凋亡2,14重要。
该技术的一个重要的限制是需要新鲜分离的原代细胞。这一程序是不使用要么以前冻结或保存在培养外周血单个核细胞或pDC的测试。的PBMC的分离是劳动密集型的,并且这些细胞具有非常有限的寿命。此外,虽然与人血液的工作应当用于防止血源性病原体标准协议。经常有变异性的几个来源与工作相关联的涉及新鲜分离的人细胞。其中是实施以分离这些细胞的不同的程序,和从供体到供体中遇到的遗传变异性。而这是不可能的,以避免供体间变异性,使用了建议的阳性对照,如测量响应于TLR7和TLR9的途径已知激动剂,将用于这些实验的一个重要的内部控制。我们观察到,一个强大的响应于TLR9途径的激动剂可以与健康的pDC响应相关联,而一个响应TLR7通路所需的抗HIV-1 3的适当的反应。
<p class ="“jove_content”">根据美国提出的意见和其他2,通常不需要从外周血单个核细胞富集的pDC的。然而,如果实验设计需要时(例如在上下文在需要的特定的pDC表面标志物耗竭)负选择是优选超过正选择,作为细胞选择过程后保持自由的抗体。孤立的pDC进行文化迅速凋亡。对于需要这些细胞的实验是在延长的时间周期中培养,培养基可以补充有IL-3。这种细胞因子诱导的pDC细胞增殖并抑制其凋亡16。然而,IL-3的使用需要被严格控制,因为它可能导致的pDC成熟或分化。这里所描述的方法结合,以重新创建先天传感期间所涉及的初始步骤的目标HIV-1感染细胞的新鲜分离的PBMC或pDC细胞。这种方法无疑是有益的EXPLOR与HIV感染有关ê早期先天免疫活动。虽然相关协议的目的是测量I型干扰素,他们可以很容易地进行修改,以衡量在识别受感染细胞的pDC细胞释放的其它生物活性分子。这些可包括:III型干扰素(IFN-λ),促炎细胞因子(如TNF-α和IL-6)和趋化因子CXCL10,CCL4,CCL5和17。
我们感谢E. Massicotte和J.主的过程中流式细胞仪和细胞分选实验,专家技术援助。此外,我们要感谢的红外对抗诊所的工作人员和所有捐助者提供血液样本。外周血样本来自谁签署知情同意书,根据赫尔辛基下批准德研究所15-9诊所RECHERCHES蒙特利尔(IRCM)的研究伦理审查委员会的研究方案宣言健康成年供体。下列试剂是通过美国国立卫生研究院艾滋病试剂计划,艾滋病,NIAID,NIH司获得的:从道格拉斯里奇曼博士的MT4细胞;与人类重组IL-2莫里斯·盖特利博士,霍夫曼 – 罗氏公司
科恩博士是加拿大首席科学家在人类反转录病毒学的收件人。这项工作是由CIHR(CIHR 111226)科恩博士和来自全宗德RECHERCHE魁北克 – 桑特(FRQ-S)艾滋病网络BEGO博士和Cohen博士支持拨款。
MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
FBS | Wisent | 080-150 | |
Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc. |
Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
Equipment | |||
Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |