Unlike celvrij HIV-1 deeltjes geïnfecteerd CD4 + T-cellen effectief waargenomen door plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs). Dit manuscript beschrijft een werkwijze waarbij perifere mononucleaire cellen (PBMC's) of geïsoleerde pDCs mede gekweekt met HIV-1 geïnfecteerde T-cellen aangeboren sensing evalueren pDCs zoals bepaald door afgifte van type I IFN.
HIV-1 aangeboren detectie vereist direct contact van geïnfecteerde CD4 + T-cellen met plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs). Om dit te bestuderen, de hier beschreven protocollen Vers geïsoleerde humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) of plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs) infecties in beide T-cellijn (MT4) of heteroloog primaire CD4 + T-cellen te detecteren. Om een goede waarneming verzekeren, is het essentieel dat PBMC direct worden geïsoleerd na bloedafname en optimale percentage geïnfecteerde T-cellen worden gebruikt. Bovendien kunnen meerdere parametrische flowcytometrische kleuring worden gebruikt om te bevestigen dat PBMC monsters bevatten verschillende cellijnen bij fysiologische verhoudingen. Een aantal controles zijn mogelijk levensvatbaarheid en functionaliteit van pDCs evalueren. Deze omvatten de aanwezigheid van specifieke oppervlakte merkers, beoordelen cellulaire reacties op bekende agonist van Toll-Like receptoren (TLR) banen, en bevestigt een gebrek aan sponmomentane type I interferon (IFN) productie. In dit systeem, vers geïsoleerde PBMCs of pDCs mede gekweekt met HIV-1 geïnfecteerde cellen in 96 putjesplaten gedurende 18-22 uur. Supernatanten uit deze co-kweken worden vervolgens gebruikt om de niveaus van bioactieve type I IFN's bepalen door het bewaken van de activering van de ISGF3 route in HEK-Blue IFN-α / β-cellen. Vóór en tijdens gelijktijdige kweekomstandigheden, kunnen targetcellen worden onderworpen aan cytometrische analyse stromen naar een aantal parameters, waaronder het percentage geïnfecteerde cellen niveaus van specifieke oppervlakte merkers en differentiële doden van geïnfecteerde cellen te bepalen. Hoewel deze protocollen oorspronkelijk ontwikkeld om type I IFN productie volgen, kunnen ze eventueel worden gebruikt om andere Imuno-modulerende moleculen vrijgemaakt uit pDCs bestuderen en om meer inzicht in de moleculaire mechanismen van HIV-1 aangeboren detectie krijgen.
Type-I IFN-producerende pDCs vormen de eerste verdedigingslinie tegen virale infecties, en als zodanig dienen als een vitale schakel tussen aangeboren en adaptieve immuniteit 1. Terwijl celvrij HIV-1 deeltjes slecht worden gedetecteerd door het aangeboren immuunsysteem, zijn HIV-1 geïnfecteerde CD4 + T-cellen effectief gedetecteerd door pDCs 2. Het voelermechanisme vereist een eerste contact tussen de virale envelop glycoproteïne (gp120) aan het oppervlak van de geïnfecteerde T-cellen en CD4-moleculen op het pDC, die vervolgens wordt gevolgd door virus vangen en internalisatie door de PDC. Daaropvolgende opname overgedragen HIV-1 RNA door TLR7 veroorzaakt de activering van de Myd88 / IRF7 route en leidt uiteindelijk aan type I-IFN productie 3. Belangrijk is dat de tweede sensor route aanwezig pDCs, wat gemedieerd door TLR9, wordt geremd door de interactie van het virale glycoproteïne, gp120, met pDC specifieke oppervlaktemarker BDCA2 4.
<p class="jove_content"> De TLR7 en TLR9 sensing paden van pDC kan mogelijk negatief gemoduleerd worden door de inzet van BST2 (ook aangeduid Tetherin of CD317) met een ander pDC-specifieke oppervlakte remmende receptor genaamd ILT7 5. BST2 expressie wordt gebracht in hoge niveaus aan het oppervlak van pDCs en sommige kankercellen, maar bij relatief lage concentraties in andere celtypes, zoals B-cellen, macrofagen en T-cellen. Belangrijk BST2 kan worden geïnduceerd door type I IFN in een aantal getransformeerde cellijnen en in primaire celculturen van humane en muriene oorsprong 6. Naast de immuun-regulerende functie, werd BST2 recent gevonden om de afgifte van HIV-1 remmen en andere omhulde virale deeltjes door verknoping ontluikende virusdeeltjes op het geïnfecteerde celoppervlak 7. In het geval van HIV-1, het virus gecodeerde eiwitten accessory U (Vpu) bleek te fungeren als een BST2 antagonist. Er wordt aangenomen dat Vpu downregulates BST2 van het celoppervlak van HIV-1-geïnfecteerde cellen, de plaats van de kettinging activiteit en als gevolg verbetert virale afgifte en verspreiden 7, hoewel dit begrip wordt betwist 8,9. Aangezien Vpu, een groot aantal volledig gevormde en volwassen nakomelingen HIV-1 deeltjes vastgehouden op het celoppervlak. Of deze tethered deeltjes effectief doelen voor het immuunsysteem sensing kon vertegenwoordigen nog steeds een open vraag. Daarnaast is het onduidelijk of Vpu type I IFN productie kon dysregulate van pDCs door het moduleren oppervlak BST2 niveaus.Vroege onderzoeken om HIV-1 detectie evalueren werden uitgevoerd met celvrij HIV-1 deeltjes die algemeen worden beschouwd slechte inductoren van type I IFN 3,10-12. Aangezien recente studies suggereren dat PBMCs en pDCs efficiënt detecteren HIV-geïnfecteerde CD4 + T-lymfocyten 2,13,14 We beschrijven hier een eenvoudige methode om aangeboren responsen veroorzaakt door pDCs bij herkenning van HIV-1-geïnfecteerde cellen di vitro te meten.
De hier beschreven protocollen meten detectie van T-cellen geïnfecteerd met GFP-gelabelde HIV-1-virussen die alleen verschillen in hun vermogen om Vpu drukken, zoals beschreven in onze recent rapport 18. Deze werkwijzen kunnen gemakkelijk worden gewijzigd om detectie van ongelabelde virussen en virussen ontbreekt andere virale genen die kan moduleren aangeboren sensing bestuderen. Als de virussen die niet hebben GFP expressie, het percentage geïnfecteerde doelcellen worden bepaald op andere wijze vóór co-cultuur, zoals p24 (capside) intracellulaire kleuring en flowcytometrie of p24 ELISA. Bovendien kunnen deze protocollen worden gebruikt met verschillende voorwerp T-cellen, waaronder diverse beschikbare cellijnen en primaire cellen.
De in dit manuscript beschreven werkwijzen hebben een aantal voordelen ten opzichte van vroege methoden voor HIV-1 detectie bestuderen. Eerst en vooral is opgericht door een aantal groepen die celvrij HIV-1 partikelen zijn slechte inductoren van type I IFN 2,13,14. De vroegtijdige studies aangevoerde oudere IFNa ELISA-gebaseerde methoden om de hoeveelheid type I-IFN geproduceerde kwantificeren. Een beperking van deze detectietechniek is dat de meeste oudere IFNa ELISA kits meten slechts één type IFNa, met uitzicht op het andere typen IFNa en IFNβ. Het gebruik van de beschreven reporter cellijnen overwint deze beperking als de concentratie van biologisch actieve vormen van humaan type I-IFN's kan worden gemeten in een keer. De techniek is zeer gevoelig, goedkoper dan de nieuwe generatie van IFN ELISA kit en vele donors grote hoeveelheden type I IFN kan gemakkelijk worden opgespoord. Desalniettemin kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met andere type I IFN uitlezing methoden zoals ELISA.
Kritische stappen: Het is belangrijk dat de kwaliteit van cellulaire componenten (zowel targets en effectors) strak gecontroleerd. Mogelijke besmetting, zelfs wanneer asymptisch, moet worden bewaakt en gecontroleerd. Zoals wij eerder vermeld, antibiotica gecontroleerde asymptomatische bacteriële besmetting en eventueel andere intracellulaire pathogenen zoals mycoplasma, kan dit immuunresponsen met die waargenomen na HIV-1-infectie, namelijk de productie van type I IFN genereren. Bovendien moeten alle reagentia vrij van LPS of andere potentiële endotoxinen zijn. Ook monitoring van PBMC en pDCs is ook belangrijk omdat de menselijke monsters vaak kan worden gevuld door onderliggende aanhoudende infecties, die normaal sensing kunnen beïnvloeden. We raden altijd inclusief de voorgestelde negatieve controles, zoals afwezigheid van doelcellen evenals co-culturen met de mock-geïnfecteerde cellen. Levensvatbaarheid van geïnfecteerde cellen is eveneens belangrijk voor een goede pDC detectie omdat type I IFN niet geproduceerd na co-kweek met apoptotische cellen 2,14.
Een belangrijke beperking van de techniek is de behoefte aan vers geïsoleerde primaire cellen. Deze procedure nietgetest met behulp van PBMC of pDCs die ofwel voorheen zijn bevroren of in cultuur gehouden. De isolatie van PBMC is arbeidsintensief en deze cellen hebben een zeer beperkte levensduur. Bovendien moet standaard protocollen voor het beschermen tegen via bloed overdraagbare pathogenen worden gebruikt tijdens het werken met menselijk bloed. Er zijn vaak meerdere bronnen van variabiliteit in verband met werkzaamheden die vers geïsoleerde menselijke cellen. Onder hen zijn de verschillende procedures uitgevoerd om deze cellen te isoleren en de erfelijke variabiliteit ondervonden van donor tot donor. Hoewel het onmogelijk is om variatie tussen donor te vermijden, het gebruik van de voorgestelde positieve controles, zoals het meten van reactie op bekende agonisten van TLR7 en TLR9 wegen, zou een belangrijke interne controle voor deze experimenten geven. We vonden dat een robuuste reactie op agonisten van de TLR9 pathway kan worden gecorreleerd met een gezonde pDC reactie, terwijl een responsieve TLR7 route is voor het goede respons tegen HIV-1 3.
<p class = "jove_content"> Op basis van de opmerkingen van ons en anderen 2, verrijking van pDCs uit PBMCs is vaak niet nodig. Indien proefopzet vereist (bijvoorbeeld in de context waarin depletie specifieke pDC oppervlakmerkers vereist) negatieve selectie voorkeur boven positieve selectie, zoals cellen vrij blijven van antilichamen na de selectieprocedure. Geïsoleerde pDCs ondergaan snelle apoptose in cultuur. Voor experimenten die deze cellen vereisen gekweekt gedurende langere tijd, kan kweekmedium aangevuld met IL-3. Deze cytokine induceert pDC proliferatie en remt de apoptose 16. Echter, IL-3 gebruik moet goed worden gecontroleerd, omdat het kan leiden tot pDC rijping of differentiatie.De hier beschreven methode combineert doel HIV-1 geïnfecteerde cellen met vers geïsoleerde PBMCs of pDCs om de eerste stappen betrokken bij aangeboren detectie opnieuw. Deze methode zal ongetwijfeld nuttig zijn om explor zijne vroege aangeboren immuunsysteem geassocieerd met een HIV-infectie. Hoewel de bijbehorende protocollen gericht op het meten van type I IFN, kunnen zij gemakkelijk worden aangepast aan andere biologisch actieve moleculen vrijgemaakt uit pDCs bij herkenning van geïnfecteerde cellen te meten. Deze kunnen omvatten: het type III-IFN (IFN-λ), pro-inflammatoire cytokinen (zoals TNF-α en IL-6) en chemokines CXCL10, CCl4 en CCL5 17.
Wij danken E. Massicotte en J. Lord voor deskundige technische assistentie tijdens flowcytometrie en celsortering experimenten. Ook willen we de IRCM kliniek personeel en alle donoren te bedanken voor het verstrekken van bloedmonsters. Perifere bloedmonsters werden verkregen van gezonde volwassen donoren die gaven schriftelijk geïnformeerde toestemming, in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki onder onderzoeksprotocollen door de ethische toetsingscommissie van het Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM) goedgekeurd. De volgende reagentia werden verkregen door middel van het NIH AIDS Reagent Program, Division van aids, NIAID, NIH: MT4 cellen van Dr. Douglas Richman; en Human rIL-2 van Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc.
Dr Cohen is de ontvanger van de Canada Research Chair in Human Retrovirology. Dit werk werd ondersteund door subsidies van CIHR (CIHR 111.226) naar Dr. Cohen en van de Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) AIDS netwerk Dr. Bego en Dr Cohen.
MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
FBS | Wisent | 080-150 | |
Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc. |
Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
Equipment | |||
Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |