A differenza privi di cellule HIV-1 particelle, cellule T CD4 + infetti siano effettivamente rilevati dalle cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC). Questo manoscritto descrive un metodo in cui le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o pDCs isolate sono co-coltura con HIV-1 le cellule T infette di valutare sensing innato da pDCs valutata dal rilascio di tipo I IFN.
HIV-1 sensing innata richiede il contatto diretto delle cellule T CD4 + infettate con le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC). Per studiare questo processo, i protocolli descritti usano appena isolate cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMC) o cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) per rilevare infezioni in entrambe le linee di cellule T (MT4) o di cellule eterologhe primarie T CD4 +. Al fine di garantire un corretto sensing, è essenziale che PBMC sono isolati immediatamente dopo il prelievo del sangue e quella percentuale ottimale di cellule T infettate vengono utilizzati. Inoltre, multi-parametrica citofluorimetrica colorazione può essere utilizzato per confermare che i campioni di PBMC contengono le diverse linee cellulari a rapporti fisiologici. Un certo numero di controlli può anche essere incluso per valutare la vitalità e la funzionalità di pDC. Tra questi, la presenza di marcatori di superficie specifici, valutando le risposte cellulari a agonisti nota di Toll-like receptors (TLR) percorsi, e confermando la mancanza di spontanea tipo I interferone (IFN) di produzione. In questo sistema, PBMC o pDCs appena isolate sono co-coltura con HIV-1 le cellule infettate in 96 pozzetti per 18-22 ore. I surnatanti di questi co-colture sono poi utilizzati per determinare i livelli di IFN di tipo I bioattivi monitorando l'attivazione della via ISGF3 in IFN-alfa cellule / beta HEK-blu. Prima e durante condizioni di co-coltura, le cellule bersaglio possono essere sottoposti ad analisi citofluorimetrica per determinare un numero di parametri, tra cui la percentuale di cellule infettate, i livelli dei marcatori di superficie specifica e differenziale uccisione di cellule infette. Anche se, questi protocolli sono stati inizialmente sviluppati per seguire la produzione di tipo I IFN, che potrebbero essere utilizzati per studiare altre molecole imuno-modulatori rilasciati da pDCs e per ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari che regolano l'HIV-1 sensing innata.
Tipo I IFN-produzione pDCs rappresentano la prima linea di difesa contro le infezioni virali, e come tale servire come un collegamento vitale tra innata e l'immunità 1. Mentre privi di cellule HIV-1 particelle sono scarsamente riconosciuti dal sistema immunitario innato, cellule T CD4 + HIV-1-infetti siano effettivamente percepite dai pDCs 2. Il meccanismo di rilevamento richiede un contatto iniziale tra la glicoproteina virale (gp120) sulla superficie della cellula infettata T e molecole CD4 sulla pDC, che è poi seguita da cattura virus e internalizzazione dal pDC. Rilevazioni successive di trasferimento di HIV-1 RNA TLR7 determinerà l'attivazione della MyD88 / IRF7 percorso e alla fine conduce al tipo-I produzione di IFN 3. È importante sottolineare che il secondo circuito di sensing presente in pDC, che è mediata da TLR9, è inibita dalla interazione della glicoproteina virale, gp120, con il PDC-specifico marcatore di superficie BDCA2 4.
<p class="jove_content"> I TLR7 e TLR9 rilevamento percorsi di pDC possono potenzialmente essere modulata negativamente l'impegno di BST2 (anche designato teterina o CD317) con un altro recettore inibitorio superficie pDC-specifica denominata ILT7 5. BST2 è espresso ad alti livelli in superficie di pDC e alcune cellule tumorali, ma a livelli relativamente bassi in altri tipi di cellule, come le cellule B, macrofagi e cellule T. Importante, BST2 può essere indotta da IFN di tipo I in un certo numero di linee di cellule trasformate e in colture cellulari primarie di origini umane e murine 6. Oltre alla sua funzione immunitaria normativo, BST2 stato recentemente trovato per inibire il rilascio di HIV-1 e altri avvolto particelle virali da particelle virali nascenti reticolazione sulla superficie cellula infetta 7. In caso di HIV-1, la proteina accessoria virus codificato U (Vpu) ha dimostrato di agire come antagonista BST2. Si ritiene che Vpu downregulates BST2 dalla superficie cellulare delle cellule HIV-1-infetti, il sito della sua cavezzazione di attività e di conseguenza aumenta rilascio virale e diffondere 7, anche se questa nozione è stata contestata 8,9. In assenza di Vpu, un gran numero di completamente formati e progenie maturo HIV-1 particelle vengono trattenuti sulla superficie cellulare. Se queste particelle frenati potrebbero rappresentare obiettivi efficaci per il rilevamento immunitario rimane ancora una questione aperta. Inoltre, non è chiaro se Vpu potesse dysregulate tipo I la produzione di IFN da pDCs modulando superficie BST2 livelli.I primi studi disegnati per valutare l'HIV-1 di rilevamento sono stati condotti utilizzando privi di cellule HIV-1 particelle, che sono generalmente considerati poveri induttori di tipo I IFN 3,10-12. Dato che gli studi recenti suggeriscono che PBMCs e pDCs efficiente percepiscono sieropositivo linfociti T CD4 + 2,13,14, descriviamo qui un metodo semplice per misurare le risposte innate innescati da pDCs accreditato in cellule HIV-1-infetti di vitro.
I protocolli descritti qui misurano rilevamento delle cellule T con infezione da HIV-1 virus GFP-tagged che differiscono solo per la capacità di esprimere Vpu, come descritto nella nostra recente relazione 18. Tuttavia, questi metodi possono essere facilmente modificati per studiare rilevamento di virus senza tag e virus privi altri geni virali che potrebbero potenzialmente modulare sensing innata. Se i virus usati non esprimono GFP, la percentuale di cellule bersaglio infette devono essere determinati da un altro mezzo prima di co-coltura, come il p24 (capside) colorazione intracellulare e citometria a flusso o p24 ELISA. Inoltre, questi protocolli possono essere usati con differenti cellule bersaglio T, tra cui una varietà di linee cellulari disponibili e cellule primarie.
I metodi descritti in questo manoscritto hanno un numero di vantaggi rispetto ai primi metodologie utilizzate per studiare HIV-1 sensing. Innanzitutto è stato stabilito da una serie di gruppi che libera HIV-1 pgli articoli sono poveri induttori di tipo I IFN 2,13,14. Inoltre, i primi studi invocato più vecchi metodi basati-ELISA IFNα per quantificare la quantità di tipo I IFN prodotto. Un limite di questa tecnica di rilevamento è che la maggior parte dei vecchi kit ELISA IFNα misurare un solo tipo di IFNα, mentre si affaccia gli altri tipi di IFNα e Interferone beta. L'utilizzo delle linee cellulari giornalista descritte supera questa limitazione come la concentrazione di tutte le forme bioattive di IFN di tipo I umano può essere misurato in una volta. La tecnica è molto sensibile, meno costoso di una nuova generazione di kit ELISA IFN e per molti donatori grandi quantità di IFN di tipo I possono essere facilmente individuati. Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per l'uso con altri di tipo I-IFN metodi di read-out, come ELISA.
Passaggi critici: E 'importante che la qualità di tutti i componenti cellulari (sia di obiettivi che effettori) essere controllati strettamente. Potenziale contaminazione, anche quando asymptomatica, deve essere monitorato e controllato. Come abbiamo accennato in precedenza, antibiotico-controllato contaminazione batterica asintomatica, e potenzialmente di altri agenti patogeni intracellulari come micoplasma, in grado di generare risposte immunitarie simili a quelli osservati dopo da HIV-1, vale a dire la produzione di tipo I IFN. Inoltre, tutti i reagenti devono essere liberi di LPS o altri potenziali endotossine. Allo stesso modo, il monitoraggio di PBMC e pDCs è anche importante dal momento che i campioni umani possono spesso essere trattate da infezioni in corso sottostanti, che possono influenzare il rilevamento normale. Si consiglia sempre inclusi i controlli negativi proposte, quali l'assenza di cellule bersaglio, nonché co-colture con cellule mock-infettate. La vitalità delle cellule infettate è importante anche per il corretto rilevamento pDC dal tipo I IFN non è prodotto a seguito della co-coltura con cellule apoptotiche 2,14.
Una importante limitazione della tecnica è la necessità di cellule primarie appena isolate. Questa procedura non è statatestato con PBMC o pDCs che erano o precedentemente congelati o tenuti in coltura. L'isolamento delle PBMC è laborioso e queste cellule hanno una durata di vita molto limitata. Inoltre, dovrebbero essere utilizzati protocolli standard per la protezione contro i patogeni ematica mentre si lavora con sangue umano. Ci sono spesso diverse fonti di variabilità associati con il lavoro che coinvolgono le cellule umane appena isolate. Tra loro ci sono le diverse procedure adottate per isolare queste cellule, e la variabilità ereditata incontrate dal donatore a donatore. Mentre è impossibile evitare variabilità tra donatore, l'uso dei controlli positivi proposti, come la misurazione risposta agli agonisti conosciuti di TLR7 e TLR9 percorsi, fornirebbe un importante controllo interno per questi esperimenti. Abbiamo osservato che una risposta forte agli agonisti del percorso TLR9 potrebbe essere correlato con una risposta pDC sano, mentre è previsto un percorso reattivo TLR7 una risposta adeguata contro l'HIV-1 3.
<p class = "jove_content"> Sulla base di osservazioni fatte da noi e altri 2, spesso non è necessario un arricchimento di pDCs da PBMC. Tuttavia, se il disegno sperimentale richiede (ad esempio nel contesto in cui è necessaria la deplezione di specifici marcatori di superficie PDC) selezione negativa è preferibile rispetto selezione positiva, come cellule restano liberi di anticorpo dopo il processo di selezione. Isolato pDCs subiscono una rapida apoptosi in coltura. Per gli esperimenti che richiedono queste cellule siano coltivate per lungo periodo di tempo, terreni di coltura possono essere integrati con IL-3. Questa citochina induce pDC proliferazione e inibisce la loro apoptosi 16. Tuttavia, IL-3 utilizzo deve essere strettamente controllato in quanto può portare a maturazione pDC o differenziazione.Il metodo qui descritto combina bersaglio da HIV-1 le cellule infettate con PBMC o pDCs appena isolate al fine di ricreare le fasi iniziali coinvolte durante il rilevamento innata. Questo metodo sarà senza dubbio utile per Explore eventi precoci immunitarie innate associate all'infezione da HIV. Anche se i protocolli associati sono finalizzati a misurare tipo I IFN, potrebbero facilmente essere modificati per misurare altre molecole bioattive rilasciate da pDCs al momento della rilevazione delle cellule infette. Questi possono includere: Tipo III-IFN (IFN-λ), citochine pro-infiammatorie (TNF-come α e IL-6) e chemochine CXCL10, CCL4, e CCL5 17.
Ringraziamo E. Massicotte e J. Signore per l'assistenza tecnica di esperti durante citometria a flusso e gli esperimenti di separazione delle cellule. Inoltre, vorremmo ringraziare il personale della clinica IRCM e tutti i donatori per la fornitura di campioni di sangue. Campioni di sangue periferico sono stati ottenuti da donatori adulti sani, che hanno firmato un consenso informato in accordo con la Dichiarazione di Helsinki sotto protocolli di ricerca approvati dal etica della ricerca board review del Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). I seguenti reagenti sono stati ottenuti attraverso il Programma reagente NIH AIDS, Divisione di AIDS, NIAID, NIH: cellule MT4 del dottor Douglas Richman; e rIL-2 umane del dottor Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc.
Il dottor Cohen è il destinatario del Canada Research Chair in Retrovirology umana. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal CIHR (CIHR 111.226) per il dottor Cohen e dal Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) rete AIDS Dr. Bego e il dottor Cohen.
MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
FBS | Wisent | 080-150 | |
Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc. |
Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
Equipment | |||
Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |