Summary
Tilstedeværelsen av høyrisiko HPV i hode og nakke svulstvev er forbundet med gunstige utfall. Den nylig utviklet RNA in situ hybridisering teknikk kalt RNAscope tillater direkte visualisering av HPV E6/E7 mRNA i FFPE vevssnitt.
Abstract
Den "gullstandard" for onkogene HPV påvisning er demonstrasjonen av transcriptionally aktiv høyrisiko HPV i svulstvev. Men påvisning av E6/E7 mRNA ved kvantitativ revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR) krever RNA ekstraksjon som ødelegger svulstvev sammenheng avgjørende for morfologisk korrelasjon og har vært vanskelig å bli vedtatt i rutinemessig klinisk praksis. Vårt nylig utviklet RNA in situ hybridisering teknologi, RNAscope, tillater direkte visualisering av RNA i formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) vev med enkelt molekyl følsomhet og enkelt celle oppløsning, noe som gjør at svært sensitive og spesifikke in situ analyse av noe RNA biomarkør i rutinemessige kliniske prøver. Den RNAscope HPV assay ble utviklet for å detektere E6/E7 mRNA av syv høyrisiko HPV-genotype (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, og 58) ved hjelp av en dam av genotype-spesifikke prober. Det har vist utmerket følsomhetog spesifisitet mot strømmen "gullstandard"-metoden for å påvise E6/E7 mRNA ved QRT-PCR. HPV status bestemmes av RNAscope er sterkt prognostisk av kliniske utfall i orofaryngeal kreftpasienter.
Introduction
Høyrisiko humant papillomavirus (HR-HPV) infeksjon utgjør ca 5% av alle krefttilfeller på verdensbasis en. Forekomsten av HPV-assosiert orofaryngeal kreft har økt i løpet av de siste tiårene, særlig blant menn. HPV-positive orofaryngeal plateepitelkarsinom (OPSCC) vil trolig utgjøre et flertall av alle hode og nakke kreft i USA i de neste 20 årene 2. Orofaryngeal plateepitelkarsinom forårsaket av HPV er assosiert med gunstige overlevelse, og svulst HPV status er en sterk og uavhengig prognostisk faktor for overlevelse tre.
Bevis for transkripsjonaktivering av de virale oncogener E6 og E7 er å anse som gullstandarden for nærvær av klinisk relevante HPV 4.. Imidlertid er påvisning av E6/E7 mRNA fra fersk svulstvev ved RT-PCR teknikken ikke praktisk i rutinemessig klinisk praksis og har vært begrenset til forskningslaboratoriene. Nylig, vi have utviklet en ny RNA ISH teknologi kalt RNAscope, noe som gjør at multiplex deteksjon i individuelle celler med én RNA-molekyl følsomhet i formalinfiksert parafin innebygde vevsprøver (FFPE) 5-10. Vi følger tre linjer av bevis for enkelt molekyl deteksjon fem. Først den RNAscope probe design og signalforsterkersystem tillatt påvisning av løssalgs HER2 genomisk DNA mål i HeLa og SK-BR-tre cellelinjer. For det andre, når sammenlignet med HER2 genomiske DNA-signaler, fordelingen av de fluoriserende intensiteter av HER2 mRNA-signal prikker i HeLa-cellene var i samsvar med ett molekyl pr dot. For det tredje, antall HER2 mRNA signal punkter per celle matchet tett HER2 mRNA kopi nummer anslått av en løsning basert kvantifisering analysen, ytterligere støtte single deteksjon molekyl. Videre gir kontra av atomkjerner med DAPI i fluoriserende mikroskopi eller med hematoxylin i lyse-feltet mikros visualisering av individuelle kjerner, which igjen tillater påvisning og kvantifisering av RNA mål på en encellet basis 10. Evnen til å analysere genuttrykk in situ i rutinemessige kliniske prøver gjør RNAscope en lovende plattform for diagnostisk patologi, spesielt de FFPE vevsnitt.F.eks-baserte analyser 10,11. Vi har utviklet en RNAscope basert analyse for å påvise HPV E6/E7 mRNA av syv høyrisiko HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 og 58) ved hjelp av en dam av genotype-spesifikke prober. Våre nyere studier i OPSCC har vist at RNAscope HPV-analysen er meget følsom og spesifikk i å bestemme HPV status på FFPE vev 12-17, og også informerer prognose i OPSCC 12,16.
Prinsippet om RNAscope teknologi har blitt beskrevet tidligere fem. Her beskriver vi den komplette RNAscope analyseprotokollen og demonstrere bruken ved påvisning av HR-HPV i FFPE tumor vev seksjoner.
Protocol
En. Sample, Utstyr, og reagensklargjøring
- Skjær vev prøven inn i blokker på 3-4 mm i tykkelse, fikse i frisk 10% nøytral bufret formalin for 16-32 timer ved romtemperatur (25 ° C), og bygge inn i parafin. Skjær FFPE i seksjoner av 5 ± 1 mikrometer tykkelse fra FFPE blokker, montere deler på lysbilder og lufttørke. Merk: Lysbildene kan lagres ved romtemperatur under uttørking i inntil tre måneder. De monterte vev slides skal stekes i en tørk over ved 60 ° C i 1 time før den RNAscope assay.
- Bring Hybridisering Oven til 40 ° C. Plasser en luftfukting papir i fuktighetskontroll skuff. Legg 50 ml dH 2 O til fukting av papir for å fukte den helt. Sett dekket skuff i ovnen til prewarm i minst 30 minutter før bruk.
- Gjør 700 ml 1x pretreat 2 Solution (10 nl, pH 6 citrate buffer) ved å fortynne 10x Pretreatment Solution i dH 2 O. Varm opp 1x pretreat 2 Løsning å koke og maintain temperaturen mellom 100-104 ° C mens hindre overkoking.
- Gjør tre L 1x vaskebuffer (0.1x SSC) ved å fortynne prewarmed 50x Wash Buffer i dH 2 O.
- Forbered 2 x 200 ml xylen og 2 x 200 ml 100% EtOH for deparaffinization under en avtrekkshette.
- Forbered 50% Hematoxylin flekker løsning og bluing reagens (0,01% ammoniakk vann) for post-flekker under en avtrekkshette.
- Forbered 200 ml xylen, 200 ml av 70%, og 2 x 200 ml 100% EtOH for dehydrering under en avtrekkshette.
- Prewarm Target sonder på 40 ° C i 10 min og bringe RTU Detection Kit reagens til romtemperatur, inkludert RTU Amp1, AMP2, AMP3, Amp4, Amp 5-Brown, og Amp6-Brown, bortsett DAB Chromogen Brown-A og Brown-B .
2. RNAscope analysen
Deparaffinization og dehydrering
Etter baking, deparaffinize vevssnitt i xylen for 2 x 5 min med hyppig omrøring, og virke uttørrendei 100% EtOH i 2 x 3 minutter med hyppig omrøring. Lufttørke i 5 min og trekke en hydrofob barriere rundt vevet seksjon med en hydrofob barriere Pen.
Forbehandlinger
- Inkuber vevssnitt med forbehandle en i 10 minutter ved RT for bråkjøling av endogen peroksidase-aktivitet, skylles i dH 2 O.
- Inkuber vevssnitt med forbehandle 2 holdes ved en koketemperatur i 15 minutter for RNA gjenfinning, skylles to ganger i dH 2 O.
- Inkuber vevssnitt med pretreat 3 for 30 min ved 40 ° C for protein fordøyelsen i HybEZ ovn, skyll to ganger i dH 2 O.
Target Probe Hybridisering
Target prober HPV-HR 7 svømmebassenget omfatter: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, og 58.. Legg HPV sonder, Ubiquitin C (UBC) og bakterielle genet dapB sonder separat på tre adjacently vevssnitt. Hybridiserer ved 40 ° C i ovnen i tohr, og skyll i 1X vaskbuffer for 2 x 2 min ved RT.
Signal Amplification
- Inkuber vevssnitt med Amp1 (forforsterker) i 30 minutter ved 40 ° C, AMP2 (bakgrunns redusering) i 15 min ved 40 ° C, AMP3 (forsterker) i 30 minutter ved 40 ° C, og Amp4 (etiketten onde) i 15 min ved 40 ° C i HybEZ ovnen. Etter hvert hybridiseringstrinnet skyll i 1X vaskbuffer for 2 x 2 min ved RT.
- Inkuber vevssnitt med Amp5 i 30 min og Amp6 i 15 min ved RT. Etter hvert inkuberingstrinnet, skyll i 1X vaskbuffer for 2 x 2 min ved RT.
Signal Detection
Inkuber vevssnitt med 01:01 DAB blandingen ved å blande like volum av Brown-A og Brown-B i 10 min ved RT, skylles to ganger i dH 2 O.
Kontra
Slide Montering
Dehydrate vevssnitt i 70%, 100% og 100% EtOH i 2 minutter hver, xylen i 5 min, beslag med xylen basert monteringsmateriale.
Representative Results
RNAscope HPV-analysen arbeidsflyt
Den RNAscope assay har et høyt strømlinjeformet arbeidsflyt som er lik IHC (figur 1). Den består av fire hovedtrinn: forbehandlinger, hybridisering, signal presiseringer og deteksjon. Det benytter en unik probe design strategi som sikrer høy fidelity signalamplifikasjon fem. I RNAscope HPV-assay, blir de syv HR-HPV probesett slått sammen, alt gjenkjent av de samme signalforsterkningssystem koblet til pepperrot-peroksydase (HRP). Spesifikke hybridiserings signaler blir detektert som brune bunnfall som er dannet av HRP-katalysert kromogene reaksjon ved hjelp av DAB som substrat, som lett kan visualiseres ved standard lyse felt mikroskopi.
Representant farging for HPV deteksjon
Figur 2 viser eksempel bilder fra farget FFPE deler av hode og nakke plateepitelkarsinom. I den HPV-positive case (figure 2A), de HR-HPV-prober oppdaget sterke punctate signaler spesielt i kreftceller. Den UBC probe detekteres en rekke punctate cytoplasmatiske signaler i både tumorceller og stromale celler (Figur 2B). Den bakterielle genet dapB probe demonstrerte en ren bakgrunn (figur 2C). I HPV-negative fall både HR-HPV-proben og dapB probe detekteres noen signaler (fig. 2D og 2F), mens det sterke signaler ble påvist ved hjelp av UBC probe (figur 2E). I dette assay, tjener UBC som positiv kontroll for å vurdere vev RNA kvalitet og dapB som negativ kontroll for bakgrunnssignaler. Scoringen for HPV status bestemmelse innebærer å undersøke alle tre lysbilder for hvert enkelt tilfelle. Fargingen nivået på den negative styreskyveren (dapB) glide brukes som cutoff: HPV positivitet er definert ved tilstedeværelsen av punctate cytoplasmiske og / eller nukleær farging som var over til signalet på dabpB lysbilde.
Figur 1. Flytskjema for RNAscope analysen. Illustrasjon RNAscope analysen arbeidsflyt. Den RNAscope analysen inneholder fire store skritt, forbehandlinger, target sondehybridisering, signalforsterkning og signaldeteksjon. Hele analysen prosedyre kan gjennomføres på 8 timer. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Eksempel bilder av RNAscope-fargede lysbilder. FFPE seksjoner farget med prober for HR-HPV, UBC (positiv kontroll) og dapB (negativ kontroll)fra to HNSCC tilfeller. AC. HPV-positiv sak. A, HR-HPV E6/E7 mRNA uttrykk i tumorceller. Inset, 40X forstørrelse vise punctate signaler. B og C) tilstøtende vev seksjoner som viser positiv UBC farging (B) og negativ for dapB (C), henholdsvis. DF) HPV-negative saken. D) ingen farging for HPV E6/E7 mRNA , lik den dapB negativ kontroll (F). E) UBC positiv farging. Klikk her for å se større bilde.
Discussion
Den RNAscope HPV-analysen tillot direkte visualisering av E6/E7 mRNA in situ i HPV-assosiert hode og nakke plateepitelkarsinom. Den RNAscope analysen er fullt kompatibel med rutinemessig fast svulstvev og bevarer vev morfologi for histopatologiske sammenhenger (figur 2). En viktig fordel med den RNAscope assay over konvensjonelle CISH metoder er at det spesifikt forsterker hybridiserings-signaler (figurene 2B og 2E) uten å forsterke bakgrunnsstøyen (figurene 2C og 2F).
I praksis kan den RNAscope HPV analyseprosedyren være fullført i løpet av 8 timer eller praktisk fordelt over to dager. Den RNAscope HPV-analysen har vært brukt til å bestemme HPV status i hode og nakke plateepitelkarsinom 12-16, viser 97% sensitivitet og 93% spesifisitet ved hjelp QRT-PCR som referansemetode 16. Konvensjonell chromogenic ISH for HR-HPV DNA er svært spesifikk, men har en sensitivitet på ~ 80% 12. Immunhistokjemisk (IHC) farging for den cellulære surrogatmarkør p16 demonstrerer utmerket følsomhet, men kan generere falske positive resultater 15,18, spesielt i nonoropharyngeal hode og nakke kreft 15. Den nåværende "gullstandarden" metode for QRT-PCR for HPV E6/E7 mRNA deteksjon krever fersk frosset vev for optimale resultater og er teknisk komplisert, noe som begrenser bruken til forskningslaboratoriet bare. I tillegg kreves det at RNA ekstraksjon som gjør det umulig å relatere HR-HPV E6/E7 mRNA uttrykk med histopatologi.
Det er flere viktige faktorer for å lykkes med den RNAscope analysen. Først, for best resultat, vev skal være løst i frisk 10% nøytral bufret formalin ved romtemperatur i 16-32 timer etter ASCO / CAP retningslinjer 19. For det andre er HybEZ ovnen anbefales siden det gjør det muligs optimal kontroll av temperatur og fuktighet for probe-hybridisering og signalforsterkningstrinn. For det tredje er det viktig å fjerne overskytende rest buffere før hvert trinn, men fortsatt holder vev-delen tørker i løpet av en hvilken som helst av disse trinnene.
Den manuelle RNAscope prosedyren som er beskrevet her er automatisert på en kommersiell lysbilde auto-farging system 10. Dette bør i stor grad forenkle standardisering av analyseforhold og sparer dyrebar manuelt arbeid i klinisk patologiske laboratorier. I tillegg har dedikert bildeanalyse programvare er utviklet 10 til automatisk identifisere cellene og farging signaler på en digitalisert lysbilde, som skal bidra til å eliminere subjektivitet og bedre reproduserbarhet i scoring.
I sammendraget, oppdager RNAscope HPV-analysen tilstedeværelsen av HR-HPV E6/E7 mRNA transkripsjoner in situ i FFPE vev. Den har en arbeidsflyt som er kjent for klinisk patologi laboraToryene ved å tillate direkte visualisering av disse i vev seksjoner. Det tilbyr en ideell plattform for å undersøke (FFPE) vevsprøver, og kan lett bli adoptert av diagnostisk patologi laboratorier.
Disclosures
Alle forfatterne er ansatt ved og eget lager i Advanced Cell Diagnostics, Inc.
Acknowledgments
Støttet delvis av NIH stipend (R43/44CA122444) og DOD BRCP stipend (W81XWH-06-1-0682) til YL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG,, et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
