MALDI-Massaspectrometrische Imaging voor onderzoek naar metabolieten in<em> Medicago truncatula</em> Wortelknolletjes
Summary
Massaspectrometrische imaging (MSI) is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om verschillende chemische stoffen ontdekken en identificeren intacte weefsels behoud van de verbindingen in hun eigen omgeving, waarin nieuwe inzichten in biologische processen kunnen leveren. Hierin een MSI werkwijze ontwikkeld voor de analyse van kleine moleculen beschreven.
Abstract
De meeste technieken die worden gebruikt om kleine moleculen te bestuderen, zoals farmaceutische middelen of endogene metabolieten, weefselextracten gebruiken die de homogenisering van het weefsel van belang dat mogelijke veranderingen in de metabole routes onderzochte 1 veroorzaken vereisen. Massaspectrometrie imaging (MSI) is een krachtige analytische tool die ruimtelijke informatie van analyten kan bieden binnen intact plakjes biologisch weefsel monsters 1-5. Deze techniek is uitgebreid gebruikt om verschillende soorten verbindingen zoals eiwitten, peptiden, lipiden en kleine moleculen zoals endogene metabolieten bestuderen. Met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie (MALDI)-MSI, kan ruimtelijke verdelingen van verschillende metabolieten gelijktijdig worden gedetecteerd. Hierin wordt een werkwijze speciaal ontwikkeld voor het uitvoeren irrelevante metabolomics MSI experimenten peulvrucht wortels en wortelknollen voorgelegd die inzicht in de biologische processen die kunnen onthullen. Dehier gepresenteerde methode toont een typische MSI workflow, van monstervoorbereiding tot beeldopname, en richt zich op de matrix toepassing stap demonstreren verschillende matrix applicatie technieken die nuttig zijn voor het opsporen van kleine moleculen zijn. Zodra de MS afbeeldingen worden gegenereerd, wordt de analyse en identificatie van metabolieten plaats besproken en aangetoond. De standaardwerkstroom hier gepresenteerde kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende weefseltypen, moleculaire species en instrumentatie.
Introduction
De groeiende gebied van metabolomics heeft veel belangrijke biologische toepassingen, waaronder de ontdekking van biomarkers, het ontcijferen van metabole routes in planten en andere biologische systemen, en toxicologie profilering 4,6-10. Een belangrijke technische uitdaging bij het bestuderen van biologische systemen is om metabolomic trajecten studeren zonder verstoring van hen 11. MALDI-MSI zorgt voor een directe analyse van intacte weefsels die gevoelige detectie van analyten in staat stelt in enkele organen 12,13 en zelfs enkele cellen 14,15.
Monstervoorbereiding is een cruciale stap in het produceren van reproduceerbare en betrouwbare massaspectrale beelden. De kwaliteit van de beelden is sterk afhankelijk van factoren zoals weefsel inbeddingsmedium, plakdikte, MALDI matrix en matrix applicatietechniek. Voor grafische toepassingen, ideaal snijdikte is de breedte van een cel (8-20 micrometer afhankelijk van het monster). MALDI vereist depositie van een organische, crystallinee matrix bevatten, typisch een zwak zuur, de monster analyt verdamping en ionisatie helpen. 16 verschillende matrices verschillende signaalintensiteiten, storende ionen en ionisatie-efficiëntie van verschillende klassen van verbindingen.
De matrix applicatietechniek speelt ook een rol in de kwaliteit van massaspectrum afbeeldingen en verschillende technieken geschikt zijn voor verschillende soorten analyten. Drie matrix applicatie methoden worden in dit protocol: airbrush, automatische sproeier, en sublimatie. Airbrush matrix toepassing is op grote schaal gebruikt in de MALDI beeldvorming. Het voordeel van airbrush matrix toepassing is dat het relatief gemakkelijk. De kwaliteit van de matrix airbrush toepassing sterk afhankelijk van de vaardigheid van de gebruiker en de neiging minder reproduceerbaar en verspreiding van analyten, in het bijzonder kleine moleculen 17 veroorzaken. Automatische spuit systemen hebben vergelijkbare mechanica aan matrix toepassing airbrush, maar have ontwikkeld om de variabiliteit gezien met handmatige airbrush toepassing verwijderen, waardoor de nevel beter reproduceerbaar. Deze methode kan soms meer tijd in beslag dan de traditionele airbrush matrix toepassing zijn. Zowel handmatige airbrush en automatische spuit systemen zijn solvent-gebaseerde matrix applicatie methoden. Sublimatie is een droge matrix applicatie techniek die meer en meer populair wordt steeds voor de massa spectrale beeldvorming van metabolieten en kleine moleculen, want het vermindert analyt diffusie, maar het het oplosmiddel nodig ontbeert te halen en te observeren grotere massa verbindingen 18.
Zelfverzekerd identificatie van metabolieten vereist meestal accurate massa metingen om vermeende identificaties gevolgd door tandem massa (MS / MS)-experimenten voor validatie, met MS / MS-spectra worden vergeleken met de normen, literatuur, of theoretische spectra te verkrijgen. In dit protocol hoge resolutie (massa oplossend vermogen van 60.000 bij m / z 400), vloeistofchromatografie (LC)-MS wordt gekoppeld aan MALDI-MSI zowel ruimtelijke informatie en zelfverzekerd identificaties van endogene metabolieten te krijgen, met behulp van Medicago truncatula wortels en wortelknollen als het biologische systeem. MS / MS experimenten kunnen direct worden uitgevoerd op het weefsel met MALDI-MSI of weefselextracten met LC-MS en gebruikt voor de validatie van metaboliet identificaties.
Dit protocol biedt een eenvoudige methode om endogene metabolieten in M. kaart truncatula, die aangepast en toegepast op MSI van kleine moleculen in verschillende soorten weefsel en biologische systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals hierboven besproken, monstervoorbereiding is de meest kritische stap in de MSI workflow. Verankering van weefsel ongelijk veroorzaken snijden moeilijk of onmogelijk in sommige gevallen. Het gedeelte grootte en voldoende equilibratietijd zijn cruciaal voor het behoud van het weefsel integriteit en het vermijden van vouwen en scheuren. Selectie van matrix en applicatietechniek een rol bij het bepalen van de typen analyten te detecteren, de ruimtelijke resolutie en reproduceerbaarheid van de resultaten spelen. Met ee…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr Jean-Michel Ane erkennen in de afdeling Agronomy op UW-Madison voor het verstrekken van Medicago truncatula monsters. Dit werk werd mede ondersteund door de financiering van de National Science Foundation (NSF) subsidie CHE-0957784, de Universiteit van Wisconsin Graduate School en de Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) en Romnes Faculteit Research Fellowship-programma (LL). EG erkent een NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).
Materials
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
Riferimenti
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3′,4′-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
