Imaging MALDI espectrometría de masas para la Investigación de metabolitos en<em> Medicago truncatula</em> nódulos de las raíces
Summary
De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una herramienta poderosa que se puede utilizar para descubrir e identificar varias especies químicas en los tejidos intactos, la preservación de los compuestos en sus ambientes nativos, que puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos. En la presente memoria un método de MSI desarrollado para el análisis de moléculas pequeñas se describe.
Abstract
La mayoría de las técnicas que se utilizan para estudiar las moléculas pequeñas, tales como fármacos o metabolitos endógenos, emplean extractos de tejidos que requieren la homogeneización del tejido de interés que podrían causar cambios en las rutas metabólicas en estudio 1. De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una poderosa herramienta analítica que puede proporcionar información espacial de analitos dentro de rebanadas intactas de muestras de tejidos biológicos 1-5. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de compuestos, incluyendo proteínas, péptidos, lípidos, y moléculas pequeñas tales como metabolitos endógenos. Con láser asistida por matriz de desorción / ionización (MALDI)-MSI, distribuciones espaciales de múltiples metabolitos pueden ser detectados simultáneamente. En esto, un método desarrollado específicamente para la realización de experimentos no orientados metabolómica MSI en las raíces de leguminosas y nódulos de las raíces se presenta lo que podría revelar una visión de los procesos biológicos que tienen lugar. Lamétodo presentado aquí muestra un típico flujo de trabajo de MSI, de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes, y se centra en la etapa de aplicación de la matriz, lo que demuestra diversas técnicas de aplicación de la matriz que son útiles para la detección de moléculas pequeñas. Una vez que las imágenes son generadas con EM, se discutieron y demostraron el análisis y la identificación de los metabolitos de interés. El flujo de trabajo estándar que aquí se presenta se puede modificar fácilmente para diferentes tipos de tejidos, especies moleculares, y la instrumentación.
Introduction
El creciente campo de la metabolómica tiene muchas aplicaciones biológicas importantes, incluyendo el descubrimiento de biomarcadores, descifrando las vías metabólicas en plantas y otros sistemas biológicos, y la toxicología de perfiles 4,6-10. Un reto técnico importante en el estudio de los sistemas biológicos es el estudio de las vías de metabolómica sin interrumpir los 11. MALDI-MSI permite el análisis directo de los tejidos intactos que permite la detección sensible de analitos en órganos individuales 12,13 e incluso células individuales 14,15.
Preparación de la muestra es un paso crucial en la producción de imágenes espectrales de masa reproducibles y fiables. La calidad de las imágenes depende en gran medida de factores tales como el tejido medio de incrustación, grosor de corte, matriz de MALDI, y la técnica de aplicación de la matriz. Para aplicaciones de formación de imágenes, espesor de corte ideal es la anchura de una celda (8-20 micras dependiendo del tipo de muestra). MALDI requiere el depósito de una orgánica, cristalinacompuesto matriz E, típicamente un ácido débil, en la muestra para ayudar a la ablación analito y la ionización. 16 Diferentes matrices de proporcionar diferentes intensidades de señal, iones interferentes, y la eficiencia de ionización de diferentes clases de compuestos.
La técnica de aplicación de la matriz también juega un papel en la calidad de las imágenes espectrales de masa y diferentes técnicas son apropiadas para diferentes clases de analitos. Tres métodos de aplicación de la matriz se presentan en este protocolo: aerógrafo, rociador automático, y la sublimación. Aplicación de la matriz del aerógrafo ha sido ampliamente utilizado en la formación de imágenes de MALDI. La ventaja de la aplicación de la matriz del aerógrafo es que es relativamente rápido y fácil. Sin embargo, la calidad de la aplicación de la matriz aerógrafo depende en gran medida de la habilidad del usuario y tiende a ser menos reproducible y causar la difusión de analitos, especialmente moléculas pequeñas 17. Los sistemas automáticos de rociadores tienen los mecánicos similares a aerógrafo aplicación de la matriz, pero have sido desarrollado para eliminar la variabilidad observada con la aplicación manual de aerógrafo, haciendo que la pulverización más reproducible. Este método puede ser a veces más tiempo que la aplicación de la matriz aerógrafo tradicional. Tanto los sistemas de rociadores automáticos aerógrafo manual y son los métodos de aplicación de la matriz a base de solventes. La sublimación es una técnica de aplicación matriz seca que se está volviendo más y más popular para la formación de imágenes de espectro de masas de los metabolitos y moléculas pequeñas, ya que reduce la difusión del analito, sin embargo, carece de la necesaria disolvente para extraer y observar compuestos de masas superiores 18.
Identificación Confiado de metabolitos normalmente requiere mediciones precisas de masa para obtener identificaciones putativos seguido de masas en tándem (MS / MS) experimentos de validación, con MS / MS espectros que se comparan con los estándares, la literatura, o espectros teóricos. En este protocolo de alta resolución (masa poder de resolución de 60.000 a m / z 400), cromatografía líquida (LC)-MS está acoplado a MALDI-MSI para obtener tanto la información espacial y las identificaciones seguras de metabolitos endógenos, utilizando Medicago truncatula raíces y nódulos de las raíces como el sistema biológico. Experimentos MS / MS se pueden realizar directamente en el tejido con MALDI-MSI o en extractos de tejidos con LC-MS y utilizados para la validación de la identificación de metabolitos.
Este protocolo proporciona un método simple para mapear metabolitos endógenos en M. truncatula, que puede ser adaptada y aplicada a MSI de pequeñas moléculas en diversos tipos de tejidos y los sistemas biológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se comentó anteriormente, la preparación de la muestra es el paso más crítico en el flujo de trabajo de MSI. Incorporación de los tejidos de manera desigual hará que el corte a ser difícil o imposible en algunos casos. El tamaño de la sección y el tiempo de equilibrio adecuado son cruciales para el mantenimiento de la integridad del tejido y evitar el plegado y lágrimas. La selección de la matriz y la técnica de aplicación tendrá un papel en la determinación de los tipos de analitos que se detecten, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Jean-Michel Ané en el Departamento de Agronomía de la Universidad de Wisconsin-Madison para proporcionar muestras de Medicago truncatula. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF) de subvención CHE-0957784, de la Universidad de Wisconsin Escuela de Postgrado y la Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) y el programa Romnes Facultad de Becas de Investigación (para SD). EG reconoce un Graduate Research Fellowship NSF (DGE-1256259).
Materials
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
Riferimenti
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3′,4′-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
