MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in<em> Medicago truncatula</em> Root noduli
Summary
Mass spettrometria di imaging (MSI) è un potente strumento che può essere utilizzato per scoprire e identificare le varie specie chimiche nei tessuti intatti, preservando i composti nel loro ambiente naturale, in grado di fornire nuove intuizioni in processi biologici. Qui un metodo MSI sviluppato per l'analisi di piccole molecole è descritto.
Abstract
La maggior parte delle tecniche utilizzate per studiare piccole molecole, come farmaci o metaboliti endogeni, impiegare estratti tissutali che richiedono l'omogeneizzazione del tessuto di interesse che potrebbe potenzialmente causare variazioni nelle vie metaboliche in fase di studio 1. Mass spettrometria di imaging (MSI) è uno strumento di analisi potente che può fornire informazioni spaziali di analiti all'interno fette intatto di campioni di tessuti biologici 1-5. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per studiare vari tipi di composti tra cui proteine, peptidi, lipidi, e piccole molecole come metaboliti endogeni. Con matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI)-MSI, distribuzioni spaziali di più metaboliti possono essere rilevati simultaneamente. Qui, un metodo sviluppato specificamente per lo svolgimento di mirati metabolomica MSI esperimenti sulle radici di legumi e noduli radicali viene presentata, che potrebbe rivelare intuizioni processi biologici che avvengono. Ilmetodo qui presentato mostra un flusso di lavoro tipico MSI, dalla preparazione del campione per l'acquisizione delle immagini, e si concentra sulla fase di applicazione matrice, dimostrando diverse tecniche applicative matrice che sono utili per rilevare piccole molecole. Una volta che vengono generate le immagini MS, l'analisi e l'identificazione dei metaboliti di interesse è discusso e dimostrato. Il flusso di lavoro standard qui presentato può essere facilmente modificato per diversi tipi di tessuto, specie molecolari, e la strumentazione.
Introduction
Il settore in crescita della metabolomica ha molte importanti applicazioni biologiche, tra cui la scoperta di biomarcatori, decifrando vie metaboliche nelle piante e negli altri sistemi biologici, e tossicologia profiling 4,6-10. Una grande sfida tecnica quando si studiano i sistemi biologici è quello di studiare percorsi metabolomica senza interrompere il loro 11. MALDI-MSI consente per l'analisi diretta dei tessuti intatti che consente il rilevamento sensibile di analiti in singoli organi 12,13 e perfino singole cellule 14,15.
La preparazione del campione è un passo cruciale nella produzione di immagini spettrali di massa riproducibili e affidabili. La qualità delle immagini dipende molto da fattori come il tessuto mezzo di inclusione, spessore di strato, matrice MALDI e tecnica di applicazione matrice. Per applicazioni di imaging, spessore della sezione ideale è la larghezza di una cella (8-20 micron a seconda del tipo di campione). MALDI richiede deposizione di un organico, crystallinpreparato a matrice e, tipicamente un acido debole, sul campione per assistere l'ablazione analita e ionizzazione. 16 differenti matrici forniscono diverse intensità di segnale, ioni interferenti, e l'efficienza di ionizzazione di diverse classi di composti.
La tecnica di applicazione matrice gioca anche un ruolo nella qualità delle immagini di spettri di massa e tecniche diverse è adatto per diverse classi di analiti. Tre modalità applicative matrice vengono presentati in questo protocollo: aerografo, spruzzatore automatico, e la sublimazione. Applicazione matrice aerografo è stato ampiamente utilizzato nella diagnostica per immagini MALDI. Il vantaggio dell'applicazione matrice aerografo è che è relativamente semplice e veloce. Tuttavia, la qualità dell'applicazione matrice aerografo dipende fortemente dall'abilità dell'utilizzatore e tende ad essere meno riproducibile e provocare la diffusione di analiti, in particolare piccole molecole 17. Sistemi di spruzzatore automatici devono meccanici simili a aerografo applicazione della matrice, ma have sviluppato per rimuovere la variabilità visto con applicazione aerografo manuale, rendendo lo spray più riproducibile. Questo metodo può essere a volte più in termini di tempo di applicazione matrice aerografo tradizionale. Sia aerografo manuale e sistemi di spruzzatore automatici sono metodi di applicazione della matrice a base di solventi. Sublimazione è una tecnica di applicazione matrice secca che sta diventando sempre più popolare per l'imaging spettrale di massa dei metaboliti e piccole molecole perché riduce analita diffusione, tuttavia, manca la necessaria solvente per estrarre e osservare composti massa superiore 18.
Individuazione Fiducioso di metaboliti in genere richiede misurazioni di massa accurata avere identificazioni putativi seguiti da massa tandem (MS / MS) esperimenti di convalida con MS / MS spettri di essere rispetto agli standard, la letteratura, o spettri teorici. In questo protocollo alta risoluzione (massa potenza di 60.000 m / z 400 risoluzione), cromatografia liquida (LC)-MS è accoppiato MALDI-MSI per ottenere sia informazioni spaziali e identificazioni sicure di metaboliti endogeni, utilizzando Medicago truncatula radici e noduli radicali come il sistema biologico. Esperimenti MS / MS possono essere eseguite direttamente sul tessuto con MALDI-MSI o su estratti di tessuto con LC-MS e utilizzati per la validazione delle identificazioni dei metaboliti.
Questo protocollo fornisce un metodo semplice per mappare metaboliti endogeni in M. truncatula, che può essere adattato e applicato al MSI di piccole molecole in vari tipi di tessuto e sistemi biologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come discusso sopra, la preparazione del campione è la fase più critica del flusso di lavoro MSI. Incorporare il tessuto non uniforme causerà sezionamento essere difficile o impossibile in alcuni casi. La dimensione del vano e adeguato tempo di equilibrio sono cruciali per mantenere l'integrità dei tessuti ed evitando piegatura e lacrime. Selezione di matrice e tecnica di applicazione giocherà un ruolo nella determinazione dei tipi di analiti da rilevare, la risoluzione spaziale, e la riproducibilità dei risul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Jean-Michel Ané presso il Dipartimento di Agronomia a UW-Madison per la fornitura di campioni truncatula Medicago. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della National Science Foundation (NSF) concessione CHE-0957784, l'Università del Wisconsin Graduate School e la Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) e il programma Romnes Ricerca Faculty Fellowship (LL). EG riconosce un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.256.259).
Materials
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
Riferimenti
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3′,4′-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
